Forskoline induite par Gonflement dans Intestinal organites: Un<em> In vitro</em> Essai pour évaluer la réponse des médicaments dans les patients atteints de fibrose kystique
Summary
This protocol describes an assay for measuring CFTR function and CFTR modulator responses in cultured tissue from subjects with cystic fibrosis (CF). Biopsy-derived intestinal organoids swell in a cAMP-driven fashion, a response that is defective (or strongly reduced) in CF organoids and can be restored by exposure to CFTR modulators.
Abstract
Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant CFTR channel in subjects with cystic fibrosis (CF). Identification of subjects that may benefit from these drugs is challenging because of the extensive heterogeneity of CFTR mutations, as well as other unknown factors that contribute to individual drug efficacy. Here, we describe a simple and relatively rapid assay for measuring individual CFTR function and response to CFTR modulators in vitro. Three dimensional (3D) epithelial organoids are grown from rectal biopsies in standard organoid medium. Once established, the organoids can be bio-banked for future analysis. For the assay, 30-80 organoids are seeded in 96-well plates in basement membrane matrix and are then exposed to drugs. One day later, the organoids are stained with calcein green, and forskolin-induced swelling is monitored by confocal live cell microscopy at 37 °C. Forskolin-induced swelling is fully CFTR-dependent and is sufficiently sensitive and precise to allow for discrimination between the drug responses of individuals with different and even identical CFTR mutations. In vitro swell responses correlate with the clinical response to therapy. This assay provides a cost-effective approach for the identification of drug-responsive individuals, independent of their CFTR mutations. It may also be instrumental in the development of future CFTR modulators.
Introduction
CF est causée par des mutations dans le gène régulateur de la conductance transmembranaire de la fibrose kystique (CFTR) qui code pour un canal anionique épithéliale. CF touche environ 85.000 personnes dans le monde 1. Plus de 2000 mutations du gène CFTR ont été identifiées ( www.genet.sickkids.on.ca ). Cette diversité explique en partie un large spectre de phénotypes de la maladie observés ( www.CFTR2.org ) 2, 3. Six classes de mutations du gène CFTR sont définies en fonction de leur effet sur l'expression et la fonction de la protéine CFTR: (I) pas de synthèse, (II) avec facultés affaiblies le trafic, (III) canal défectueux gating, (IV) conductance modifié, (V) les niveaux de normalement réduite fonctionnant CFTR et (VI) ayant une déficience cellulaire stabilité de la surface 4. Bien que les mutations du gène CFTR communes sont bien étudiés, la fonction CFTR et relation avec l'état clinique restent poorly compris au niveau de l'individu, en particulier pour le grand groupe de rares "orphelines" mutations ( www.CFTR2.org ) 1, 3.
Récemment, les médicaments ont été développés qui ciblent la protéine CFTR de manière spécifique à la mutation. Deux classes de CFTR médicaments protéiques de ciblage sont actuellement en usage clinique et ont des modes d'action distincts. Potentialisateurs, tels que le VX-770, d' améliorer l'open-probabilité de CFTR mutant apicale-localisé et agissent directement sur leur addition aux cellules 5. Correcteurs, tels que le VX-809, restaurer le trafic de endoplasmique misfolded CFTR réticulum localisée et nécessitent une pré-incubation avec des cellules avant que les effets sont observés 6. Le potentialisateur de CFTR, le VX-770, a été enregistrée pour les sujets atteints de la mutation G551D 7, 8, ainsi que pour les huit autresCFTR gating mutations, y compris S1251N 9; ensemble, ces mutations sont portés par 5% de tous les sujets des FC. D' autres essais cliniques ont indiqué que le VX-770, combiné avec le correcteur VX-809, a des effets limités mais significatifs sur la fonction pulmonaire et provoque une diminution des taux d'exacerbation chez les sujets homozygotes pour la mutation F508del porté par 45-50% des patients 10, 11.
essais cliniques classiques pour identifier les sujets de drogue sensible dans les 50% restants des patients atteints de mucoviscidose sont coûteux et prend du temps et ne sont pas réalisables pour les personnes ayant de très rares génotypes de CFTR. Novel, méthodes personnalisées rentables sont cruciales pour correspondre au nombre croissant de modulateurs de CFTR à des individus porteurs de tout type de mutation CFTR. Jusqu'à présent, l'inclusion d'essai de groupes de patients porteurs de mutations du gène CFTR spécifique a été guidée par des études utilisant mutant transfection du gène CFTR dans hdes systèmes de cellules eterologous, suivie par des études électrophysiologiques dans des chambres d' Ussing 5, 6, 12. En raison d'un manque de modèles animaux de CF adéquates, des études d'efficacité des médicaments dans les cellules épithéliales bronchiques air-liquide-interfaces différenciées dérivées de matériaux explants pulmonaires CF ont été utilisées pour le développement de médicaments 13, 14, 15. Cependant, la disponibilité limitée des tissus d'explants pulmonaires et les procédures invasives pour obtenir des cellules bronchiques de sujets sans maladie en phase terminale d'entraver l'analyse des mutations du gène CFTR moins fréquentes et prévenir le dépistage des drogues d'une manière personnalisée. Pour surmonter ces limitations, les tissus «accès facile», comme organites colorectaux, les cellules des voies respiratoires nasales, et les cellules des voies respiratoires dérivées de cellules souches pluripotentes induites, sont actuellement à l'étude pour les traitements médicamenteux personnalisés.
<p class= "jove_content"> Auparavant, nous avons établi des protocoles à des cellules souches épithéliales culture de tout organe digestif sous forme de 3D organites 16, 17. facteurs de croissance pour le côlon / rectum humain, les conditions de culture impliquent définis (épithéliale Growth Factor (EGF), Gastrin, Wnt-3A, R-spondine 3 (Rspo3), et Noggin) combiné avec de petites molécules (nicotinamide, A83-01, et SB202190) dans une matrice de membrane basale. Dans ces conditions, les cellules souches individuelles ou de petits fragments de tissu développent dans fermées, kystique, des structures 3D formées par un épithélium hautement polarisé avec son côté de base orientée vers l'extérieur. Tous les types de cellules apparaissent généralement dans leurs rapports et positions normales. Organites peuvent être étendues sur de longues périodes par rupture mécanique hebdomadaire et re-placage. Ils sont génétiquement et phénotypiquement stables et peuvent être stockés, ce qui permet l' expansion à long terme et de la bio-banking 17. Ils se prêtent àtoutes les manipulations de cellules biologiques standards / génétiques et des techniques analytiques développées pour les lignées cellulaires 2D 18.Nous avons récemment démontré que la fonction CFTR peut être facilement mesurée en organites colorectaux dans une enflure induite par la forskoline (FIS) dosage 19, 20. Lorsqu'il est exposé à la forskoline (FSK) ou, en variante, à la toxine du choléra, organoïdes augmentent rapidement leur adénosine monophosphate cyclique (AMPc) niveaux, ce qui entraîne à son tour l'ouverture du canal CFTR 19. Organites d'individus sains ou de sujets avec des mutations du gène CFTR associées à la fonction résiduelle, seront ensuite gonfler comme une conséquence de l' ion et le transport de l' eau à la lumière organoïdes, l'équivalent in vitro de la diarrhée sécrétoire. La réponse des organites FIS colorectales a été montré précédemment pour être entièrement dépendant de la CFTR, comme indiqué par les organites provenant d'individus CFTR-null, unnd par l'utilisation d'inhibiteurs de CFTR pharmacologiques spécifiques 19. Les grands ensembles de données spécifiques au sujet peuvent être obtenus en quelques semaines après la prise d'une biopsie.
Pour le dosage de la FIS décrit en détail ici, organites sont cultivées à partir de biopsies rectales qui peuvent être obtenus à tout âge et avec seulement une gêne limitée 21. Organites sont repiquées chaque semaine par une rupture mécanique dans cryptes simples qui RESEAL facilement et forment de nouveaux organites. Pour exécuter le test FIS, ~ 30-80 de ces petits organites dissociées sont étalées dans chaque puits d'une plaque à 96 puits 19. Le jour de l'essai, les organites sont colorées avec du vert de la calcéine, un colorant fluorescent perméable aux cellules qui est retenu à l'intérieur des cellules vivantes, ce qui facilite l'imagerie en temps réel. Ensuite, FSK, ce qui augmente l'AMPc intracellulaire et active CFTR ainsi, est ajouté afin de stimuler le gonflement organoïde. Potentialisateurs qui agissent sur le CFTR apicale sont ajoutés simultanément wvec la forskoline, alors que les correcteurs qui rétablissent le trafic de CFTR sont ajoutés 24 heures avant l'addition de Fsk. Le gonflement organoide est quantifiée par une analyse d'image automatisé qui calcule l'augmentation relative de la superficie totale de tous les objets fluorescents pour chaque point de temps après l'addition de forskoline.
3D organoide gonflement fournit des avantages et des inconvénients sur les lectures CFTR électrophysiologiques existantes en 2D cellules des voies respiratoires cultivées dans des chambres de Ussing. Un avantage majeur est le débit de l'essai de gonflement. Les cellules sont cultivées et testées en utilisant un seul type de milieu de culture, et un technicien expérimenté peut culture jusqu'à 25 échantillons organoïdes sur une base hebdomadaire tout en quantifiant environ 1200 points de données par semaine dans 12 échantillons de patients. Nous tapons classiquement une seule condition expérimentale par des mesures double ou en triple par plaque et répéter ces mesures en trois points de temps d'incubation indépendants. Au total, environ 300-500 sIngle organoide structures sont ensuite mesurées par condition expérimentale, ce qui conduit à des mesures très précises de la fonction CFTR avec la variabilité technique limitée. Cette précision nous permet de définir clairement les différences de fonction résiduelle et la réponse à des modulateurs de CFTR et nous permet de prendre facilement des effets de fond génétiques entre les patients porteurs de mutations du gène CFTR identiques 19, 22, 23, 24, 25. La qualité des données peut être facilement évaluée à partir d'images de microscope. Alors que la FIS est entièrement dépendant de la CFTR, il est une mesure de résultat indirect pour la fonction CFTR, son hors lecture causé par le couplage du transport d'ions pour le transport des fluides. Cela contraste avec les mesures de la fonction CFTR directe dans des chambres de Ussing, qui mesurent les courants ioniques transépithéliaux 26. chambres Ussing permettent la stimulation de sélection de apical ou basolatéral compartments (dont le test organoide ne permet pas); par perméabilisation membranes basolatérale, la apical anion sécrétion dépendant de la CFTR peut être mesurée de manière sélective 27.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous fournissons un protocole complet pour la génération, l'expansion, la congélation et la décongélation des organites colorectales humaines. Alors que nous avons établi des cultures de organoïdes humains il y a quelque temps 17, il a parfois avéré difficile d'établir la technologie dans d' autres laboratoires sans formation pratique. Nous prévoyons que ces protocoles remplaceront une telle formation.
Wnt-3A-milieu conditionné est l'u…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le programme des FC fondation néerlandaise (NCFS), ZonMW (40-00812-98-14103), le Fonds de recherche de l'Hôpital de Wilhelmina enfants et CZ et Zilverenkruis / Achmea HIT-CF. Nous tenons à remercier S. Heida-Michel, M. Geerdink, KM de Winter-de Groot, et G. Berkers (Département de pneumologie pédiatrique, Hôpital de Wilhelmina enfants, UMC Utrecht), et RHJ Houwen (Département de gastro-entérologie pédiatrique, Wilhelmina Hôpital pour enfants, UMC Utrecht) pour approcher les patients et d'obtenir les biopsies pour la génération d'un Biobanque CF.
Materials
| Advanced Dulbecco’s Modified Eagles Medium with Nutrient Mixture F-12 Hams (Ad-DF) 500ml | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #12634 | stored at 4 °C |
| GlutaMax | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #35050 | stored at 4 °C |
| Hepes | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | # 15630-056 | stored at 4 °C |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #15140-122 | stored at -20 °C |
| 96 well culture plate | Cellstar | #655180 | |
| 24 well culture plate | Cellstar | #662160 | |
| 6 well culture plate | Cellstar | #657160 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (-) CaCl2 (-) MgCl2) (DPBS) | Life Technologies: Gibco | #14190-094 | stored at 4 °C |
| Dulbecco’s Modified Eagles Medium (DMEM) 500ml | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #31966-021 | For Wnt-3A Conditioned Medium Production. Stored at 4 °C |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Bovogen | #SFBS LOT#11113 | For Wnt-3A Conditioned Medium Production. Stored at -20 °C |
| L Wnt3A cell line | ATCC | #CRL-2647 | For Wnt-3A Conditioend Medium Production. |
| TOP/FOP plasmids | Millipore | #17-285 | For measuring Wnt activity |
| pTK-Renilla | Promega | #E2241 | For measuring Wnt activity |
| HEK-293 | ATCC | #CRL-1573 | For measuring Wnt activity |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | #E1910 | For measuring Wnt activity |
| Zeocin | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #R250-01 | For Wnt-3A Cell line selection |
| B27 supplement | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #17504-044 | stored at -20 °C |
| N-Acetylcysteine | Sigma Aldrich | #A9165-5G | stored at -20 °C |
| Nicotinamide | Sigma Aldrich | #N0636 | stored at -20 °C |
| Human Epithelial Growth Factor (hEGF) | PrepoTech | #AF-100-15 | stored at -20 °C |
| Gastrin | Sigma Aldrich | #G9145 | stored at -20 °C |
| TGFb type I Receptor inhibitor (A83-01) | Tocris | #2939 | stored at -20 °C |
| Y-27632 dihydrochloride (RhoKi) | Selleckchem | #S1049 | stored at -20 °C |
| p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190) | Sigma Aldrich | #S7067 | stored at -20 °C |
| Primocin | InvivoGen | #ant-pm-1 | stored at -20 °C |
| Human Noggin (hNoggin) | PrepoTech | #120-10C | stored at -20 °C |
| Human R-spondin 3 (hRspo-3) | R&D Systems | #3500-RS/CF | stored at -20 °C |
| Vancomycin | Sigma Aldrich | #861987- 250mg | stored at -20 °C |
| Gentamycin | Life Technologies: Gibco | #15710-049 | stored at -20 °C |
| Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | #431788 | Stored at 4 °C |
| Matrigel | Corning | #354230 | stored at -80 °C |
| TryplE Express | Life Technologies: Gibco | #12605-010 | for trypsinizing organoids for freezing |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Life Technologies: Gibco | #12648010 | for freezing |
| Calcein | Life Technologies: Gibco | #C3100MP | stored at -20 °C |
| Forskolin | R&D Systems | #1099-50 mg | stored at -80 °C |
| Lumacaftor (VX-809) | Selleckchem | #s1565 | stored at -80 °C |
| Ivacaftor (VX-770) | Selleckchem | #s1144 | stored at -80 °C |
| Name of Reagents/Material | Solvent | Stock Concentration | Final Concentration |
| GlutaMax | 200 mM | 2m M | |
| Hepes | 1 M | 10 mM | |
| Penicillin/Streptomycin | 10K U/ml 10K µg/ml | 100 U/ml 100 µg/ml | |
| Zeocin | 100 mg/ml | 125 µg/ml | |
| B27 supplement | 100 x | 1 x | |
| N-Acetylcysteine | MiliQ H20 | 500 mM | |
| Nicotinamide | DPBS | 1 M | 10 mM |
| Human Epithelial Growth Factor (hEGF) | DPBS 0.1%BSA | 0.5 mg/ml | 50 ng/ml |
| Gastrin | DPBS | 100 µM | 10 nM |
| TGFb type I Receptor inhibitor (A83-01) | DMSO | 5 mM | 500 nM |
| Y-27632 dihydrochloride (RhoKi) | DMSO | 10 mM | 10 µM |
| p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190) | DMSO | 30 mM | 10 µM |
| Primocin | 50 mg/ml | 100 µg/ml | |
| Human Noggin (hNoggin) | DPBS 0.1%BSA | 100 µg/ml | 100 ng/ml |
| Human R-spondin 3 (hRspo-3) | varies per lot | 300 ng/ml | |
| Vancomycin | 10 mg/ml | 50 µg/ml | |
| Gentamycin | 10 mg/ml | 50 µg/ml | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | MiliQ H20 | 0.5 M | 2 mM |
| Calcein | DMSO | 10 µg/ml | 3.3 ng/ml |
| Forskolin | DMSO | 10 mM | variable |
| Lumacaftor (VX-809) | DMSO | 20 mM | variable |
| Ivacaftor (VX-770) | DMSO | 20 mM | variable |
References
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