Целенаправленное плазматической мембраны Поставка гидрофобной Cargo инкапсулированы в жидком кристалле наночастицы Carrier
Summary
Жидкокристаллический наночастицами (LCNP) nanocarrier эксплуатируется в качестве носителя для контролируемой доставки гидрофобного груза к плазматической мембране живых клеток.
Abstract
Контролируемая поставка агентов лекарственного средства / визуализации для клеток имеет решающее значение для развития терапевтических средств и для изучения процессов клеточной сигнализации. В последнее время наночастицы (NPS) показали значительные перспективы в развитии таких систем доставки. Здесь жидкокристаллическая НП (LCNP) система доставки основанное была использована для контролируемой доставки нерастворимого в воде краситель, 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine перхлорат (DIO), внутри ядра НП в гидрофобной области плазмы мембранный бислой. Во время синтеза наночастиц, краситель эффективно включен в гидрофобное ядро LCNP, как это было подтверждено с несколькими спектроскопических анализов. Конъюгирование производное холестерина пегилированного к поверхности NP (DIO-LCNP-ПЭГ-Хол) позволило связывание красителя загруженным NPs к плазматической мембране в клетках НЕК 293T / 17. Времяразрешенная лазерной сканирующей конфокальной микроскопии и Ферстер резонансный перенос энергии (FRET) томография подтвердила пропускив оттоку Диу из ядра LCNP и его введения в плазму мембранный бислой. И, наконец, поставка DiO как LCNP-PEG-Чхоль ослабляется цитотоксичность DiO; НП форма DiO выставлены ~ 30-40% меньшую токсичность по сравнению с DiO свободным избавлены от массы раствора. Такой подход демонстрирует полезность LCNP платформы в качестве эффективного механизма для доставки мембраны специфических и модуляции гидрофобных молекул грузах.
Introduction
С момента появления взаимодействия наноматериалов (материалов ≤ 100 нм, по меньшей мере, в одном измерении) с живыми клетками, постоянная цель состояла в том, чтобы воспользоваться уникальными размерами зависящих от свойств наночастиц (NPS) для различных областей применения. Эти приложения включают клеток и тканей маркировки / обработки изображений (как в пробирке и в естественных условиях), в режиме реального времени зондирования, и контролируемой доставки лекарств и других грузов 1. Примерами таких соответствующих свойств NP включают в себя зависящее от размера эмиссии полупроводниковых нанокристаллов (квантовых точек, квантовых точек); в фототермические свойства наночастиц золота; большая несущая способность водной сердцевины липосом; и баллистическая проводимость углерода аллотропов, такие как одностенных углеродных нанотрубок и графена.
В последнее время значительный интерес возник в использовании NPs для контролируемой модуляции лекарственных средств и других грузов, таких как контраст / построения изображенияджентльмены. Здесь суть заключается в существенно повысить / оптимизировать общую растворимость, обеспеченную дозу, время циркуляции, и в конечном итоге оформление груза наркотиков, поставляя его в качестве препарата NP. Это стало известно как NP-опосредованной доставки лекарств (NMDD), и в настоящее время имеется семь FDA утвержденных лекарственные NP для использования в клинике для лечения различных видов рака и сотни больше на различных стадиях клинических испытаний. По сути, цель состоит в том, чтобы "достичь большего с меньшими затратами;" то есть, чтобы использовать NP как строительные леса , чтобы доставить больше лекарства с меньшим количеством дозирующих администраций, пользуясь большой площади поверхности: объем (например, твердые частицы, такие как КТ и оксидов металлов) ЯЭУ или их большой внутренний объем для загрузки большие грузовые полезных нагрузок (например, липосомы или мицеллы). Целью здесь является снижение необходимости в нескольких системно доставленных режимов дозирования в то время как в то же время продвижения водной стабильности и улучшения циркуляции, в частности, длясложные гидрофобные грузов наркотиков, что, в то время как высокоэффективна, плохо растворимы в водных средах.
Таким образом, цель работы, описанной здесь в том, чтобы определить жизнеспособность с помощью нового NP помост для специфической и контролируемой доставки гидрофобных грузов к липофильной плазматической мембраны бислой. Мотивация для работы была присуща ограниченная растворимость и трудности в доставке гидрофобных молекул в клетки из водной среды. Как правило, доставка таких гидрофобных молекул требует использования органических растворителей (например, ДМСО) или амфифильных поверхностно -активных веществ (например, полоксамеры), которые могут быть токсичными и компромиссом клеток и тканей жизнеспособность 2 или мицеллы носители, которые могут иметь ограниченную внутреннюю нагрузку производственные мощности. NP – носитель выбран здесь был роман жидкокристаллический NP (LCNP) препарат разработан ранее 3 и что было показано ранее для достижения ~ 40 раз Улучшение эффективности противоопухолевого препарата доксорубицина в культивируемых клетках 4.
В работе, описанной в данном документе, представитель грузовой выбранный был потенциометрического мембранного красителя, 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine перхлорат (DIO). DiO представляет собой нерастворимый в воде краситель , который использовался для Антероградный и ретроградной трассировку в живых и фиксированных нейронах, мембранного потенциала измерений, а также для общей мембраны маркировки 5, 6, 7, 8, 9. Благодаря своей гидрофобной природы, DIO , как правило , добавляют непосредственно к монослоев клеток или тканей , в кристаллической форме 10, или его инкубируют при очень высоких концентрациях (~ 1-20 мкМ) после разбавления от концентрации исходного раствора 11, 12.
Содержание "> Здесь подход был применение к LCNP платформе, многофункциональная НП которого внутреннее ядро полностью гидрофобными и поверхность которого одновременно гидрофильными и поддается биоконъюгации, как средство доставки для DiO. DiO встроен в ядро LCNP в процессе синтеза , а поверхность НП затем функционализированные с холестерином фрагментом пегилированного для продвижения мембраны связывания с DIO-LCNP ансамбля к плазматической мембране. Такой подход привел к системе доставки, которая размечены DIO в плазматической мембране с большей точностью и мембранным жительства времени , чем свободная форма Диу избавлены от массы раствора (DIO бесплатно). кроме того, этот метод показал , что LCNP-опосредованной доставки Диу существенно модулирует и гонит скорость конкретного разделения красителя в липофильной плазматической мембраны бислой. Это достигается при одновременном снижении цитотоксичность свободного препарата на ~ 40%, обеспечивая его в качестве препарата LCNP. <p clпопка = "jove_content"> Предполагается, что методология, описанная здесь, будет мощным позволяет технику для исследователей, работа которых связана или требует сотовой доставки сильно гидрофобного грузов, которые плохо растворимы или полностью не растворяется в водном растворе.Protocol
Representative Results
Discussion
Продолжающееся цель NMDD является контролируемое нацеливание и доставку лекарственных средств для клеток и тканей, в сочетании с одновременным улучшением эффективности лекарственного средства. Один конкретный класс молекул лекарственного средства, для которых это представляет серье…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Программой финансирования NRL (Base Unit MA041-06-41-4943 работа). ON поддерживается Национальным исследовательским советом докторант Research Associateship.
Materials
| 1-ethyl-3-(3-(dimethylamino)-propyl)carbodiimide hydrochloride (EDCA) | ThermoFisher | E2247 | |
| 3,3′-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO) | Sigma Aldrich | D4292-20MG | Hazardous/ make stock solution in DMSO |
| Cholesterol poly(ethylene glycol) amine hydrochloride | Nanocs, Inc. | PG2-AMCS-2k | |
| Countess automated cell counter | ThermoFisher | C10227 | |
| Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) | Sigma Aldrich | 468495-100MG | Hazardous/ make stock solution in DMSO |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ThermoFisher | 21063045 | Warm in 37°C before use |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | ThermoFisher | 14040182 | Warm in 37°C before use |
| Dynamic light scattering instrument | ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK) | ||
| Fibronectin Bovine Protein, Plasma | ThermoFisher | 33010018 | Make stock solution 1mg/mL using DPBS. Use 20-30 µg/mL for coating MetTek dish, 2 h@ 37°C |
| Formaldehyde (16%, W/V) | ThermoFisher | 28906 | Hazardous, dilute to 4% using DPBS |
| Human embryonic kidney cells (HEK 293T/17) | American Type Culture Collection | ATCC® CRL-11268™ | |
| Live cell imaging solution (LCIS) | ThermoFisher | A14291DJ | Warm in 37°C before use |
| MatTek 14 mm # 1.0 coverglass insert cell culture dish | MatTek corporation | P35G-1.0-14-C | |
| Modified Eagle Medium (DMEM) containing 25 mM HEPES | ThermoFisher | 21063045 | Warm in 37°C before use |
| N-hydroxysulfosuccinimide sodium salt (NHSS) | ThermoFisher | 24510 | |
| Nikon A1si spectral confocal microscope | Nikon Instruments | ||
| Trypan Blue Stain (0.4%) | ThermoFisher | T10282 | mix as a 50% to the cell suspension before counting the cells |
| Zeta potential instrument | ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK) | ||
| Ultrasonic Processor | Sonics and Materials Inc | GEX 600-5 | |
| Mini Cetntrifuge | Benchmark | Mini-fuge-04477 | |
| PD-10 Sephadex™ G-25 Medium | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| Bio-Rad ChemiDoc XRS Imaging System | Bio-RAD | 76S/07434 | |
| Trypsin-EDTA(0.25%), phenol red | ThermoFisher | 25200056 |
References
- Nag, O. K., Field, L. D., Chen, Y., Sangtani, A., Breger, J. C., Delehanty, J. B. Controlled actuation of therapeutic nanoparticles: an update on recent progress. Ther. Deliv. 7 (5), 335-352 (2016).
- Galvao, J., Davis, B., Tilley, M., Normando, E., Duchen, M. R., Cordeiro, M. F. Unexpected low-dose toxicity of the universal solvent DMSO. FASEB J. 28 (3), 1317-1330 (2014).
- Spillmann, C. M., Naciri, J., Anderson, G. P., Chen, M. S., Ratna, B. R. Spectral tuning of organic nanocolloids by controlled molecular interactions. ACS Nano. 3 (10), 3214-3220 (2009).
- Spillmann, C. M., Naciri, J., Algar, W. R., Medintz, I. L., Delehanty, J. B. Multifunctional Liquid Crystal Nanoparticles for Intracellular Fluorescent Imaging and Drug Delivery. ACS Nano. 8 (7), 6986-6997 (2014).
- Timmers, M., Vermijlen, D., Vekemans, K., De Zanger, R., Wisse, E., Braet, F. Tracing DiO-labelled tumour cells in liver sections by confocal laser scanning microscopy. J. Microsc. 208 (Pt 1), 65-74 (2002).
- Mufson, E. J., Brady, D. R., Kordower, J. H. Tracing neuronal connections in postmortem human hippocampal complex with the carbocyanine dye DiI. Neurobiol Aging. 11 (6), 649-653 (1990).
- Köbbert, C., Apps, R., Bechmann, I., Lanciego, J. L., Mey, J., Thanos, S. Current concepts in neuroanatomical tracing. Prog. Neurobiol. 62 (4), 327-351 (2000).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and DiO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends Neurosci. 12 (9), 333-341 (1989).
- Gan, W. B., Bishop, D. L., Turney, S. G., Lichtman, J. W. Vital imaging and ultrastructural analysis of individual axon terminals labeled by iontophoretic application of lipophilic dye. J. Neurosci. Methods. 93 (1), 13-20 (1999).
- Godement, P., Vanselow, J., Thanos, S., Bonhoeffer, F. A study in developing visual systems with a new method of staining neurones and their processes in fixed tissue. Development. 101 (4), 697-713 (1987).
- Ragnarson, B., Bengtsson, L., Haegerstrand, A. Labeling with fluorescent carbocyanine dyes of cultured endothelial and smooth muscle cells by growth in dye-containing medium. Histochemistry. 97 (4), 329-333 (1992).
- Korkotian, E., Schwarz, A., Pelled, D., Schwarzmann, G., Segal, M., Futerman, A. H. Elevation of intracellular glucosylceramide levels results in an increase in endoplasmic reticulum density and in functional calcium stores in cultured neurons. J. Biol. Chem. 274 (31), 21673-21678 (1999).
- Garrett, R. H., Grisham, C. M. . Biochimie. , (2013).
- Berne, B. J., Pecora, R. . Dynamic Light Scattering. , 41155-41159 (2000).
- Kremers, G. J., Piston, D. W., Davidson, M. W. . Basics of FRET Microscopy. , (2016).
- Chen, H., Kim, S., Li, L., Wang, S., Park, K., Cheng, J. X. Release of hydrophobic molecules from polymer micelles into cell membranes revealed by Förster resonance energy transfer imaging. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6596-6601 (2008).
- Campling, B. G., Pym, J., Galbraith, P. R., Cole, S. P. C. Use of the MTT assay for rapid determination of chemosensitivity of human leukemic blast cells. Leukemia Res. 12, 823-831 (1988).
- Nag, O. K., Naciri, J., Oh, E., Spillmann, C. M., Delehanty, J. B. Lipid raft-mediated membrane tethering and delivery of hydrophobic cargos from liquid crystal-based nanocarriers. Bioconjug. Chem. 27 (4), 982-993 (2016).
- Karve, S., et al. Revival of the abandoned therapeutic wortmannin by nanoparticle drug delivery. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (21), 8230-8235 (2012).
