ローカルフィールド蛍光顕微鏡：無傷の心の中に携帯電話の信号のイメージング
Summary
心臓では、分子事象は器官の電気的および収縮機能を調整します。ここで紹介する地元の視野蛍光顕微鏡技術のセットは、無傷の心の中の細胞の変数の記録を可能にします。心機能を定義するメカニズムを識別することは心が病的な状況下でどのように機能するかを理解する上で重要です。
Abstract
心臓では、分子シグナリング研究は、通常、単離された筋細胞で行われています。しかしながら、このような虚血および不整脈などの多くの病的状態は、完全に全臓器レベルで理解することができます。ここでは、無傷の心の中の細胞の信号の測定を可能にするローカルフィールド蛍光顕微鏡（LFFM）の分光技術を提示します。技術は、蛍光シグナルを記録するランゲンドルフ灌流心臓および光ファイバの組み合わせに基づいています。 LFFMは正常および病的条件下で心を勉強する心血管生理学の分野で様々な用途があります。複数の心臓の変数は異なる蛍光指示薬を用いてモニターすることができます。これらは、細胞質ゾルの[Ca 2+]、イントラ筋小胞体の[Ca 2+]および膜電位が含まれます。外因性蛍光プローブが励起され、放出される蛍光はLFFM落射蛍光技術の三つの異なるアレンジで検出します本論文での。これらの技術の中で中心的な違いは、励起用の励起光が変調されている方法で使用される光源の種類です。連続波LFFM（CLFFM）は、励起用の連続レーザ光を使用しながら、パルスLFFM（PLFFM）は、レーザ光パルスを使用しています。最後に、発光ダイオード（LED）は、第3の光源として使用しました。この非コヒーレント構成は、パルス状のLED蛍光顕微鏡（PLEDFM）と呼ばれています。
Introduction
心臓は心臓血管系の中心的な器官です。心臓の収縮は、細胞内の[Ca 2+] iの増加によって開始されます。細胞内Ca 2+放出における電気的興奮と変化の関係は、歴史的に、酵素的に解離した細胞1、2で研究されています。しかし、心臓の細胞は、電気的であり、代謝的及び機械的に結合された3、4。単離された場合、筋細胞だけでなく、物理的にカップリングしていないですが、異なる層から筋細胞を解離5中に混合されます。また、電圧クランプ条件下で単離された細胞の研究から浮上している巨大な利点、6、7、8電気シンシチウムALWAとして心の本質的な性質にもかかわらず、YS組織3に存在するものから細胞を解離する方法を機能的に異なるという問題を提起します。
本稿では、我々は、無傷の心臓における局所電場蛍光顕微鏡（LFFM）技術の使用により、心臓生理学の知識で得られた進歩について説明します。 LFFMは、細胞質ゾルのCa 2+、イントラ筋小胞体（SR）のCa 2+および膜電位などの複数の生理学的変数を測定するための蛍光指示薬を使用しています。これらの測定は、同時に心室圧9に関連して10、心電図9、電気的活動電位（APS）、イオン電流の記録とケージド化合物4、11のフラッシュ光分解を得ることができます。また、これらの測定値は、近い高い周波数で無傷の心臓をペーシングすることによって得ることができます生理率rと。いくつかの記事9、11、12、13、14は LFFM技術を使用して、我々のグループによって公開されているが、この技術に関連した技術的な複雑の推定は、心臓や他の臓器におけるex vivoの生理現象を研究する上での大規模な使用を妨げてきました。
LFFM技術（ 図1）は、組織と接触しているマルチモード光ファイバを使用して得られたエピ蛍光測定値に基づいています。任意の接触の蛍光イメージング技術と同様に、光学的分解能は、ファイバの直径と開口数（NA）に依存します。ファイバのNAが高い小径の測定の空間分解能を増加させます。 NASおよび繊維径は、0.22から0.66まで、50ミクロンからそれぞれ1mmとの範囲とすることができます。にNAのしわは、より大きな立体角から到来する光子を受け入れることによって信号対雑音比（S / N）に信号を改善します。落射蛍光装置として機能させるために、光ビームは、非球面レンズまたはレンズとファイバ一致NA落射蛍光対物レンズで光ファイバに集光されます。このマッチングは、励起用およびフルオロフォアによって放出された光子をバック収集するためのエネルギー伝達を最大化します。
組織内にロードされた外因性の蛍光標識を励起するために、異なる光源及び照明モードを利用することができます。パルス局所視野蛍光顕微鏡3、12（PLFFM）を使用して我々の先駆的な研究では、低コストのピコ秒レーザー（ 図1a、PLFFM）を用います。光源のこのタイプは、実質的に起因する色素を漂白することなく、照明領域の下のフルオロフォア分子の励磁大きな画分の大きな利点を有しています短パルス持続時間12へ。また、超短パルスの使用は、色素12の蛍光寿命の評価を可能にしました。蛍光寿命は、Ca 2+に結合した色素分子の割合を定量化するために使用することができる特性です。残念なことに、パルス間の振幅のパルスと変動の時間的なジッタは、色素に結合するリガンドによって生じる蛍光の変化が大きい場合に、この実験ストラテジーの適用を制限します。
連続波（CW）レーザは、通常LFFM（ 図1b、CLFFM）の主照明源として使用されます。レーザビームは、連続的に、組織を照明することができるか、ferroelectrically調節することができます。ビームの強誘電体の変調は、光のマイクロ秒のパルスの生成を可能にします。この変調は、外部ハードウェアによって制御することができます。この手順では、劇的トンを低減するだけでなく彼の光パルスの時間的ジッタだけでなく、異なる波長の光を混合することができます。光の混合は、異なるレーザからの多重線によって行われます。結果として、異なるスペクトル特性を有する複数の色素は、例えば、生理学的変数の種々の測定を実行するために励起することができるRhod-2細胞質ゾルの Ca 2+のための、MagFluo4イントラSR の Ca 2+、ジ-8-ANEPPS用用膜電位。
LFFM光源としてレーザは、存在する種々の利点があるが、他のタイプの光源は、発光ダイオード（LED）などを用いることができます。この場合、励起光源は、InGaNのLED（ 図1c、PLEDFM）から成っていました。伝導帯から電子が価電子帯の正孔と再結合するときのLEDにおいて、光子が自然に放出されます。固体レーザとの違いは、発光が他の光子によって刺激されないことです。これは、非コヒーレントなビームをもたらすとLEDの広いスペクトル放射。
ハイパワーLEDの異なる種類を使用することができます。 Fluo-4またはマグのFluo-4を使用して記録ディ-8-ANEPPSを使用して、APの記録のためにおよびCa 2+過渡現象のために、我々は485nmの（青）で、典型的なピーク発光および20nmの半分の幅を有するLEDを使用しました（ 図1D）。 Rhod-2で記録した Ca 2+過渡現象のために、LEDは540nmの（緑）、35 nmの（ 図1D）の半分の幅で、典型的なピーク発光を有していました。 LEDは、バンドの波長で発光するので、それらのスペクトル放射を絞り込むためのフィルタを必要とします。また、パルス光は、20マイクロ秒の持続時間で1.6キロヘルツのレートで生成することができます。 LEDは、高速パワーMOSFET電界効果トランジスタを用いてパルスしました。異なる指標との同時記録は時間多重LEDによって行うことができます。残念ながら、LEDによって放射される光は、レーザ光に比べて光ファイバに集中することはより困難です。このように、私たちの主な欠点LEDをることは、それらの放出プロファイルは、メイン軸からの角度変位（±15°）を持っており、補助光学部品は、それを修正するために使用しなければならないことです。
前述の光学的構成のすべてにおいて、励起光は、ダイクロイックミラーを用いて反射されます。ビームは、その後、組織に配置されているマルチモード光ファイバに非球面レンズと顕微鏡対物レンズによって集束されます。任意の落射蛍光装置のように、ダイクロイックミラーは、また、放射された光から励起を分離するのに役立ちます。放出された光スペクトルは、任意の反射された励起を除去するために、バリアフィルタを通って戻って移動します。最後に、放出された光は光検出器（ 図1）上に目的に集束されます。
光から電流への変換は、シリコンアバランシェフォトダイオードによって実行されます。これらのダイオードは、高速応答、低光の検出を可能にする高感度を持っています。ザアバランシェフォトダイオードによって生成される光電流は、2つの方法で増幅することができる：トランスインピーダンス増幅器は、帰還抵抗素子（ 図1eの）を有するまたは電圧（ 図1F）に電流を変換する積分器。第一のアプローチを使用して、出力電圧は、光電流と帰還抵抗に比例します。ピコ秒レーザパルスの抵抗検出の典型的な例は、 図2a、2b及び2cに示されています。パネル2aは、トランスインピーダンスアンプの出力を示し、パネル2bは、アスタリスク（*）で示された区間の時間展開を示しています。ピーク追跡アルゴリズムは、蛍光応答12のピーク（赤）とベース（緑）を検出するために実装されました。ベース蛍光の測定は、周囲LIGによって導入アバランシェフォトダイオードの暗電流および干渉の両方の情報を提供しますHTと電磁結合。ピークと塩基の表現は、 図2cに示されています。この図は、鼓動しているインコの心臓の心周期中の Ca 2+に結合した色素（Rhod-2）が発する蛍光を示しています。
第二の方法では、積分器の出力電圧は、電流と容量性フィードバック（ 図2D、2E、及び2F）の関数です。 図2Fは、2つの連続した統合サイクルを示していますなし外部照明およびパルスLEDから照射された光パルスと第二と第一。詳細な説明は 、 図2Gおよび2Hに示されています。このアプローチは、より面倒が、によりフィードバックコンデンサにおける熱雑音が存在しないため、より大きなS / Nを提供します。機器は、励起光の全ての制御および多重化を生成し、ヘッドステージの統合及び解像度を指示するタイミング段階を含みますらの期間。これは、通常、データのオンライン回帰を計算することによって、統合された出力信号のデジタル分化を行うデジタル信号処理回路を用いて行われます。抵抗性フィードバックを用いた場合には、任意のA / D取得ボードを使用することができます。
最後に、我々のLFFM技術は、非常に汎用性であり、複数の領域から記録するように適合させることができます。光路中にビームスプリッタを追加すると、私たちは2本の光ファイバに光を分割することができます。各光ファイバは、その後、外因性の蛍光プローブから、独立して、励起する組織と記録放出の異なる領域に配置することができます。この変更は、生理学的変数にどのように影響するかを解剖学的な地域差を評価するために私達を許可します。 図3は、2本の光ファイバを経電気または細胞内の[Ca 2+] iレベルのウィットを測定するために使用されるようにCW励起光を分割するために使用されるビームスプリッタを示します時間マイナー侵襲。経た信号は、1つの心内膜上のファイバと心室壁の心外膜層の上に他方を配置することによって記録することができます。したがって、LFFM技術は、異なる領域における細胞シグナルの経時変化を測定する能力を有しており、地域の変化は、病理学的状況で起こるかどうかをテストするために使用することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
本稿では、心筋細胞のex vivoでの機能を評価するために、ローカルフィールドの蛍光技術を説明するのに集中しています。接続された環境でのこれらの細胞の研究だけではなく、より生理的であるだけでなく、臓器レベルの病理を評価するための非常に適切です。興奮収縮連関（ECC）を基礎となる細胞事象は、細胞内Ca 2+動態（Rhod 2細胞質ゾルのCa 2+、マグFLUO4 SRのCa …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、提示の仕事の重要な議論のための博士アリシアMattiazziに感謝します。この作品は、ALEにNIH（R01 HL-084487）からの助成金によってサポートされていました。
Materials
| Sodium chloride | Sigma | 7647-14-5 | |
| D-(+)-glucose | Sigma | 50-99-7 | |
| Potassium chloride | Sigma | 7447-40-7 | |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | |
| Sodium phosphate | Sigma | 10049-21-5 | |
| Calcium chloride solution | Sigma | 10043-52-4 | |
| Magnesium chloride solution | Sigma | 7786-30-3 | |
| Sodium hyrdoxide | Sigma | S-8045 | |
| 0.2um nylon membrane filter | Whatman | 7402-004 | |
| Manifold MPP | Warner | 64-0216 | |
| 21G1.5 Precision glide needle | B-D | 305167 | |
| Black Braided silk string (non-absorbable surgical suture) | AllMech Tech | LOOK-SP105 | |
| Heparin sodium injection 1000USP/mL | AllMech Tech | NDC63323-540-11 | |
| DMSO D8779 | Sigma | 67-68-5 | |
| Blebbistatin | Sigma | 856925-71-8 | |
| Pluronic F-127 20% solution | Biotium | 59004 | |
| Materflex C/L peristaltic pump | Cole-Parmer | 77122-26 | |
| Isostim stimulator | World Precision Instruments | A320RC | |
| Waveform generator | Teledyne Lecroy | WaveStation 2012 | |
| Ultrasonic cleaner FS20 | Fisher Scientific | 1533530 | |
| Tygon tubing ID:1/32" OD:3/32" Wall 1/32" | Component Supply | TET-031A | |
| Tygon tubing ID:3/32" OD:5/32" Wall 1/32" | Component Supply | TET-094A | |
| Adapter luer lock to 3-way valve | Cole-Parmer | EW-31200-80 | |
| Tee adapters and plastic fittings | Cole-Parmer | 6365-90 | |
| Plastic clamp | WaterZoo | 2465 | |
| Peltier | TE Technology | TE-127-2.0-2.5 | |
| Rhod-2AM | ThermoFisher Scientific | R1245MP | |
| Di-8-ANEPPS | ThermoFisher Scientific | D3167 | |
| Mag-Fluo-4AM | ThermoFisher Scientific | M14206 | |
| Acupunture needles | LHASA | TC1.20×13 | |
| 60mL BD syringe with luer-lok | Fisher Scientific | 14-820-11 | |
| LabView | National Instruments | ||
| Speed vacuum Eppendorf Vagufuge | Fisher Scientific | 07-748-13 | |
| Digital signal processing circuit DSP TMS 320 | Texas Instrument | ||
| Longpass Dichroic mirror 567nm | ThorLabs | DMLP567L | |
| Objective 10X NA 0.25 DIN AchromaticFinite Intl Standard Objective | Edmund Optics | Stock# 33-437 | |
| Objective 20X NA 0.40 DIN Achromatic Finite Intl Standard Objective | Edmund Optics | Stock# 33-438 | |
| Longpass colored glass filter 590 nm | ThorLabs | FGL590 | |
| Green Nd-YAG laser 532nm, 500mW | |||
| Micromanipulator for laser | Siskiyou | MX130R | |
| Multimode fiber optic 200µm NA 0.39 | ThorLabs | FT200UMT | |
| LEDs blue | Lumileds | L135-B475003500000 | |
| LEDs green | Lumileds | L135-G525003500000 | |
| Cube beam splitter, non-polarizing | ThorLabs | BS007 | |
| 36" Length, Dovetail Optical Rail | Edmund Optics | 54-402 | |
| 2.5" Width, Dovetail Carrier | Edmund Optics | 54-404 | |
| 0.75" Travel, micrometer stage | Edmund Optics | 37-983 | |
| Dovetail optical rail 3" | ThorLabs | RLA075/M | |
| Dovetail rail carrier 1" | ThorLabs | RC1 | |
| Avalanche photodiode Helix 902 | Digi-Key | HELIX-902-200 | |
| Objective holder XY Translator | ThorLabs | ST1XY-S | |
| Aluminum breadboard 6"x6" | ThorLabs | MB6 | |
| Nexus otpical table 4'x6' | ThorLabs | T46HK | |
| Stainless steel cap screws | ThorLabs | HW-KIT5/M | |
| Acrylic sheet | Home Depot/Lowes | ||
| Sylgard Silicone elastomer kit | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Epoxy gel | Walmart/Home Depot | 2-part 5 min clr 1oz | |
| 21G1.5 Precision glide needle | B-D | 305167 | |
| 23G Precision glide needle | B-D | 305145 | |
| Mounting base, 25mmx75mmx10mm | ThorLabs | BA1/M | |
| Wire shelve posts 36" | Alera | AALESW59PO36SR | |
| Wire shelves | Alera | ALESW582424SR | |
| Post and angle clamp | ThorLabs | SWC/M-P5 | |
| Glass syringe for dye chamber | Wheaton | W851020 | |
| Rubber stopper | Home Science Tools | CE-STOP01C | |
References
- Fabiato, A., Fabiato, F. Contractions induced by a calcium-triggered release of calcium from the sarcoplasmic reticulum of single skinned cardiac cells. J Physiol. 249 (3), 469-495 (1975).
- Mitra, R., Morad, M. A uniform enzymatic method for dissociation of myocytes from hearts and stomachs of vertebrates. Am J Physiol. 249 (5), 1056-1060 (1985).
- Escobar, A. L., et al. Developmental changes of intracellular Ca2+ transients in beating rat hearts. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (3), H971-H978 (2004).
- Ramos-Franco, J., Aguilar-Sanchez, Y., Escobar, A. L. Intact Heart Loose Patch Photolysis Reveals Ionic Current Kinetics During Ventricular Action Potentials. Circ Res. 118 (2), 203-215 (2016).
- Mitra, R., Morad, M. A uniform enzymatic method for dissociation of myocytes from hearts and stomachs of vertebrates. Am J Physiol. 249, H1056-H1060 (1985).
- Fischmeister, R., DeFelice, L. J., Ayer, R. K., Levi, R., DeHaan, R. L. Channel currents during spontaneous action potentials in embryonic chick heart cells. The action potential patch clamp. Biophys J. 46 (2), 267-271 (1984).
- Banyasz, T., Horvath, B., Jian, Z., Izu, L. T., Chen-Izu, Y. Profile of L-type Ca(2+) current and Na(+)/Ca(2+) exchange current during cardiac action potential in ventricular myocytes. Heart Rhythm. 9 (1), 134-142 (2012).
- Apkon, M., Nerbonne, J. M. Characterization of two distinct depolarization-activated K+ currents in isolated adult rat ventricular myocytes. J Gen Physiol. 97 (5), 973-1011 (1991).
- Valverde, C. A., et al. Transient Ca2+ depletion of the sarcoplasmic reticulum at the onset of reperfusion. Cardiovasc Res. 85 (4), 671-680 (2010).
- Valverde, C. A., et al. Phospholamban phosphorylation sites enhance the recovery of intracellular Ca2+ after perfusion arrest in isolated, perfused mouse heart. Cardiovasc Res. 70 (2), 335-345 (2006).
- Escobar, A. L., et al. Role of inositol 1,4,5-trisphosphate in the regulation of ventricular Ca(2+) signaling in intact mouse heart. J Mol Cell Cardiol. 53 (6), 768-779 (2012).
- Mejía-Alvarez, R., et al. Pulsed local-field fluorescence microscopy: a new approach for measuring cellular signals in the beating heart. Pflügers Arch. 445 (6), 747-758 (2003).
- Ferreiro, M., Petrosky, A. D., Escobar, A. L. Intracellular Ca2+ release underlies the development of phase 2 in mouse ventricular action potentials. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302 (5), H1160-H1172 (2012).
- Kornyeyev, D., et al. Calsequestrin 2 deletion shortens the refractoriness of Ca2+ release and reduces rate-dependent Ca2+-alternans in intact mouse hearts. J Mol Cell Cardiol. 52 (1), 21-31 (2012).
- Mattiazzi, A., Argenziano, M., Aguilar-Sanchez, Y., Mazzocchi, G., Escobar, A. L. Ca2+ Sparks and Ca2+ waves are the subcellular events underlying Ca2+ overload during ischemia and reperfusion in perfused intact hearts. J Mol Cell Cardiol. 79, 69-78 (2015).
- Kornyeyev, D., Reyes, M., Escobar, A. L. Luminal Ca(2+) content regulates intracellular Ca(2+) release in subepicardial myocytes of intact beating mouse hearts: effect of exogenous buffers. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 298 (6), H2138-H2153 (2010).
- Wang, Z. G., Fermini, B., Nattel, S. Repolarization differences between guinea pig atrial endocardium and epicardium: evidence for a role of Ito. Am J Physiol. 260, H1501-H1506 (1991).
- Liu, D. W., Gintant, G. A., Antzelevitch, C. Ionic bases for electrophysiological distinctions among epicardial, midmyocardial, and endocardial myocytes from the free wall of the canine left ventricle. Circ Res. 72 (3), 671-687 (1993).
- Litovsky, S. H., Antzelevitch, C. Transient outward current prominent in canine ventricular epicardium but not endocardium. Circ Res. 62 (1), 116-126 (1988).
- Lukas, A. Electrophysiology of Myocardial Cells in the Epicardial, Midmyocardial, and Endocardial Layers of the Ventricle. J Cardiovasc Pharmacol Ther. 2 (1), 61-72 (1997).
- Antzelevitch, C., Fish, J. Electrical heterogeneity within the ventricular wall. Basic Res Cardiol. 96 (6), 517-527 (2001).
- Gomez, A. M. Modulation of electrical heterogeneity by compensated hypertrophy in rat left ventricle. Am J Physiol. 272 (3 Pt 2), H1078-H1086 (1997).
- Efimov, I. R. Innovation in optical imaging: looking inside the heart. Heart Rhythm. 4 (7), 925-926 (2007).
- Boukens, B. J., Efimov, I. R. A century of optocardiography. IEEE Rev Biomed Eng. 7, 115-125 (2014).
- Zhang, H., Iijima, K., Huang, J., Walcott, G. P., Rogers, J. M. Optical mapping of membrane potential and epicardial deformation in beating hearts. Biophysics J. 111 (2), 438-451 (2016).
