Lokale Field Fluorescens Mikroskopi: Billedbehandling Cellular Signaler i intakte hjerter
Summary
I hjertet, molekylære begivenheder koordinere elektrisk og kontraktile funktion af organet. Et sæt lokale felt fluorescensmikroskopi teknikker præsenteres her muliggør optagelsen af cellulære variabler i intakte hjerter. Identifikation mekanismer definerer hjertefunktion er kritisk i at forstå, hvordan hjertet fungerer under patologiske situationer.
Abstract
I hjertet, er molekylære signalering undersøgelser udføres sædvanligvis i isolerede myocytter. Men mange patologiske situationer såsom iskæmi og arrhytmier kan kun forstås fuldt ud i hele organniveau. Her præsenteres den spektroskopiske teknik lokale felt fluorescensmikroskopi (LFFM), der tillader måling af cellulære signaler i den intakte hjerte. Teknikken er baseret på en kombination af en Langendorff perfunderet hjerte og optiske fibre til at optage fluorescerende signaler. LFFM har forskellige anvendelser inden for kardiovaskulær fysiologi for at studere hjertet under normale og patologiske tilstande. Flere kardiale variabler kan overvåges ved hjælp af forskellige fluorescerende indikatorer. Disse omfatter cytosolisk [Ca2 +], intra-reticulum [Ca2 +] og membranpotentialer. De eksogene fluorescerende prober er begejstrede og den udsendte fluorescens detekteres med tre forskellige arrangementer af LFFM epifluorescens tekniks præsenteret i dette papir. De centrale forskelle mellem disse teknikker er den type lyskilde anvendes til excitation og på måde excitationslyset er moduleret. Den pulserende LFFM (PLFFM) anvender laser lysimpulser mens kontinuert bølge LFFM (CLFFM) anvender kontinuerlig laserlys til excitation. Endelig blev lysemitterende dioder (LED) anvendes som en tredje lyskilde. Denne ikke-kohærent arrangement kaldes pulseret LED fluorescensmikroskopi (PLEDFM).
Introduction
Hjertet er det centrale organ i det kardiovaskulære system. Hjertets kontraktion initieres af en stigning i intracellulær [Ca2 +]. Forholdet mellem elektrisk ophidselse og ændringer i intracellulær Ca2 + frigivelse er blevet historisk undersøgt i enzymatisk dissocierede celler 1, 2. Men hjerteceller er elektrisk, metabolisk og mekanisk koblet 3, 4. Når isoleret, myocytterne er ikke kun fysisk frakoblet, men myocytter fra forskellige lag blandes under dissociation fem. På trods af de enorme fordele, der er opstået fra studiet af isolerede celler under spænding clamp betingelser, 6, 7, 8 iboende karakter af hjertet som en elektrisk syncytium always rejser spørgsmålet om, hvordan funktionelt forskellige dissocieres celler fra de tilstedeværende i vævet 3.
I dette manuskript, beskriver vi de fremskridt, der er opnået i viden om hjerte-fysiologi ved brug af lokal felt fluorescens mikroskopi (LFFM) teknikker i ubeskadiget hjerte. LFFM bruger fluorescerende indikatorer til at måle flere fysiologiske variable såsom cytosolisk Ca2 +, reticulum (SR) intra Ca 2+ og membranpotentialet. Disse målinger kan opnås samtidigt og sammen med ventrikel tryk 9, 10, elektrokardiogrammer 9, elektriske aktionspotentialer (APS), ioniske aktuelle optagelser og flash fotolyse af bur forbindelser 4, 11. Desuden kan disse målinger opnås ved pacing det intakte hjerte ved højere frekvenser tætr til fysiologiske satser. Selvom flere artikler 9, 11, 12, 13, 14 er blevet offentliggjort af vores gruppe ved hjælp LFFM teknikker har formodning om tekniske kompleksitet, der er forbundet med denne teknik forhindret sin massive brug i at studere ex vivo fysiologiske fænomener i hjertet og andre organer.
Den LFFM teknik (figur 1) er baseret på epifluorescens målinger foretaget under anvendelse af en multimode optisk fiber i kontakt med vævet. Som enhver kontakt fluorescensimagografi teknik, den optiske opløsning afhænger af diameteren og den numeriske apertur (NA) af fiberen. En højere NA og mindre diameter af fiberen vil øge den rumlige opløsning af målingerne. NA'er og fiberdiametre kan variere fra 0,22 til 0,66, og fra 50 um til 1 mm. Ikrøl NA vil forbedre signal-støjforholdet (S / N) ved at acceptere fotoner ankommer fra et større rumvinkel. For at kunne fungere som en epifluorescens enhed, er lysstrålen fokuseret ind i den optiske fiber med en asfærisk linse eller et epifluorescens mål, hvor NA af linsen og fiberen kamp. Denne matching maksimerer energioverførsel for excitation og til opsamling tilbage fotonerne udsendes af fluoroforen.
For at ophidse de eksogene fluorescerende indikatorer indlæst i vævet, kan forskellige lyskilder og belysning modes udnyttes. Vores banebrydende undersøgelser under anvendelse af pulseret lokale område fluorescensmikroskopi 3, 12 (PLFFM) anvendte en billig picosekund laser (figur 1a, PLFFM). Denne type af lyskilde har den store fordel, spændende en stor brøkdel af fluoroforen molekyler under belysningen område uden væsentligt blegning farvestoffet grundden korte pulsvarigheder 12. Derudover er brugen af ultrakorte impulser muligt at vurdere fluorescenslevetiden af farvestoffet 12. Fluorescenslevetiden er en egenskab, der kan anvendes til at kvantificere den del af farvestofmolekyler bundet til Ca2 +. Desværre er den tidsmæssige rysten af impulserne og variationer i amplitude fra puls-til-puls begrænse anvendelsen af denne eksperimentelle strategi til tilfælde, hvor ændringen i fluorescens produceret af ligandbinding til farvestoffet er stor.
Kontinuerlig Wave (CW) lasere er normalt anvendes som den vigtigste lyskilde i LFFM (figur 1b, CLFFM). Laserstrålen kan løbende belyse væv eller kan ferroelectrically moduleres. Det ferroelektriske modulation af strålen at der genereres et mikrosekund lysimpulser. Denne modulation kan styres af ekstern hardware. Denne procedure reducerer ikke kun dramatisk than tidslige jittering af lysimpulser men tillader også blande bjælker af forskellige bølgelængder. Blandingen af bjælker gøres ved multipleksing stråler fra forskellige lasere. Som følge heraf kan flere farvestoffer med forskellige spektrale egenskaber exciteres til at udføre målinger af en række fysiologiske variable, for eksempel Rhod-2 for cytosolisk Ca2 +, MagFluo4 til intra-SR Ca2 + og di-8-ANEPPS for membranpotentiale.
Selvom lasere stede forskellige fordele som lyskilde i LFFM, kan andre typer af lyskilder anvendes, herunder lysemitterende dioder (LED). I dette tilfælde excitationslyskilden bestod af en InGaN LED (figur 1c, PLEDFM). I lysdioder, er fotoner spontant udsendes, når elektroner fra ledningsbåndet rekombinere med huller i valensbåndet. Forskellen med faststoflasere, er, at emissionen ikke er stimuleret af andre fotoner. Dette resulterer i en ikke-kohærent stråle oget bredere spektral emission til LED'er.
Der kan anvendes forskellige typer af høj LED'er. For AP optagelser med Di-8-ANEPPS og for Ca indspillet 2 + transienter hjælp Fluo-4 eller Mag-Fluo-4, anvendte vi en LED, der har en typisk topemission ved 485 nm (blå) og en halv bredde på 20 nm (figur 1d). For Ca2 + transienter optaget med Rhod-2, LED havde en typisk peak emission ved 540 nm (grøn) og en halv bredde 35 nm (figur 1d). Lysdioder udsender i et band bølgelængde og derfor kræver filtre til at indskrænke deres spektrale emission. Desuden kan pulseret lys genereres ved en hastighed på 1,6 kHz med en varighed på 20 mikrosekunder. LED'erne blev pulseret med en hurtig effekt-MOSFET felteffekttransistor. Samtidige optagelser med forskellige indikatorer kan udføres ved tid-multipleksing lysdioderne. Desværre, lys udsendt af LED'erne er vanskeligere at fokusere på en fiberoptisk sammenlignet med en laserstråle. Således største ulempe ved osing lysdioder er, at deres emissionsprofiler har kantede forskydninger (± 15 °) fra hovedaksen, og en ekstra optik skal bruges til at rette det.
I alle de optiske konfigurationer tidligere beskrevne, er ekscitationslyset reflekteres ved hjælp af et dikroisk spejl. Strålen efterfølgende fokuseret af en asfærisk linse og en mikroskopobjektiv på en multimode fiber optik, der er placeret på vævet. Som i enhver epifluorescens arrangement, det dikroiske spejl tjener også til at adskille excitering fra det udsendte lys. Den udsendte lysspektrum rejser tilbage gennem en barriere filter til fjernelse af eventuelt reflekteret excitation. Endelig er det udsendte lys fokuseret med et mål på en fotodetektor (figur 1).
Transduktionen fra lys til elektrisk strøm udføres ved silicium avalanche fotodioder. Disse dioder har en hurtig respons og en høj følsomhed tillader detektering svagt lys. Detfotostrøm fremstillet af avalanche fotodioder kan amplificeres på to måder: a overføringsimpedansforstærker har en resistiv feedback-element (figur 1e) eller ved en integrator til at konvertere den nuværende til en spænding (fig 1f). Anvendelse af den første fremgangsmåde, udgangsspændingen er proportional med fotostrøm og feedback modstand. Et typisk eksempel på den resistive påvisning af picosekund laserimpulser er vist i figur 2a, 2b og 2c. Panel 2a viser outputtet af overføringsimpedansforstærker og panel 2b viser en tidsekspansion af intervallet angivet med en stjerne (*). En top sporing algoritme blev gennemført til påvisning af top (rød) og bunden (grøn) til de fluorescerende responser 12. Målingen af basen fluorescens giver oplysninger om både den mørke strøm af avalanche-fotodiode og interferenser indført ved omgivelsernes light og elektromagnetisk kobling. En repræsentation af toppe og baser er vist i figur 2c. Denne figur illustrerer fluorescens udsendt af farvestoffet (Rhod-2) bundet til Ca2 + under hjertecyklussen af et bankende parakit hjerte.
Ved den anden metode, udgangsspændingen af integratoren er en funktion af strømmen og kapacitive feedback (fig 2d, 2e og 2f). Figur 2f viser to på hinanden følgende integration cyklusser: den første med ingen ekstern belysning og den anden med påsat lysimpulser fra en pulseret LED. En detaljeret beskrivelse er vist i figur 2g og 2h. Denne fremgangsmåde, selv om mere besværlig, tilvejebringer et større S / N på grund af fraværet af termiske støj i feedback kondensator. Instrumentet har en timing fase, der genererer al den kontrol og multiplexing af excitationslyset og kommandoer hovedtrin integration og resET perioder. Dette er normalt udført med et digitalt signalbehandlingskredsløb, der også udfører en digital differentiering af det integrerede udgangssignal ved at beregne en on-line regression af data. I tilfælde af anvendelse af en resistiv feedback kan enhver A / D erhvervelse board anvendes.
Endelig vores LFFM teknik er meget alsidigt og kan tilpasses til at optage fra mere end én region. Tilføjelse af en stråledeler ind i strålegangen tillader os at spalte lyset i to optiske fibre. Hver optisk fiber kan derefter placeres på forskellige områder af et væv til, uafhængigt, excite og optage emission fra de eksogene fluorescerende prober. Denne modifikation tillader os at vurdere, hvor anatomiske regionale forskelle påvirke fysiologiske variable. Figur 3 viser en stråledeler, der anvendes til at opdele CW excitationslyset, således at to optiske fibre anvendes til at måle transmural elektrisk eller intracellulært [Ca2 +] niveauer with minor-invasiv. Transmurale signaler kan optages ved at anbringe én fiber på endokardiet og den anden på epicardiet lag af den ventrikulære væg. Derfor LFFM teknik har evnen til at måle tidsforløbet af cellulære signaler i forskellige regioner og kan anvendes til at teste om forekomme regionale ændringer under patologiske situationer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dette papir er centreret i beskriver lokale område fluorescensteknikker at evaluere funktionen af hjertemyocytter ex vivo. Undersøgelsen af disse celler i en koblet miljø er ikke kun mere fysiologisk, men er også meget egnet til vurdering orgel-level patologier. De cellulære begivenheder underliggende excitation-kontraktion kobling (ECC) kan evalueres ved hele organniveau med anvendelsen af molekylære prober, der overvåger intracellulær Ca2 + dynamics (Rhod 2 cytosoliske Ca2 +,</su…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Alicia Mattiazzi for kritisk diskussion af det præsenterede arbejde. Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra NIH (R01 HL-084.487) til ALE.
Materials
| Sodium chloride | Sigma | 7647-14-5 | |
| D-(+)-glucose | Sigma | 50-99-7 | |
| Potassium chloride | Sigma | 7447-40-7 | |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | |
| Sodium phosphate | Sigma | 10049-21-5 | |
| Calcium chloride solution | Sigma | 10043-52-4 | |
| Magnesium chloride solution | Sigma | 7786-30-3 | |
| Sodium hyrdoxide | Sigma | S-8045 | |
| 0.2um nylon membrane filter | Whatman | 7402-004 | |
| Manifold MPP | Warner | 64-0216 | |
| 21G1.5 Precision glide needle | B-D | 305167 | |
| Black Braided silk string (non-absorbable surgical suture) | AllMech Tech | LOOK-SP105 | |
| Heparin sodium injection 1000USP/mL | AllMech Tech | NDC63323-540-11 | |
| DMSO D8779 | Sigma | 67-68-5 | |
| Blebbistatin | Sigma | 856925-71-8 | |
| Pluronic F-127 20% solution | Biotium | 59004 | |
| Materflex C/L peristaltic pump | Cole-Parmer | 77122-26 | |
| Isostim stimulator | World Precision Instruments | A320RC | |
| Waveform generator | Teledyne Lecroy | WaveStation 2012 | |
| Ultrasonic cleaner FS20 | Fisher Scientific | 1533530 | |
| Tygon tubing ID:1/32" OD:3/32" Wall 1/32" | Component Supply | TET-031A | |
| Tygon tubing ID:3/32" OD:5/32" Wall 1/32" | Component Supply | TET-094A | |
| Adapter luer lock to 3-way valve | Cole-Parmer | EW-31200-80 | |
| Tee adapters and plastic fittings | Cole-Parmer | 6365-90 | |
| Plastic clamp | WaterZoo | 2465 | |
| Peltier | TE Technology | TE-127-2.0-2.5 | |
| Rhod-2AM | ThermoFisher Scientific | R1245MP | |
| Di-8-ANEPPS | ThermoFisher Scientific | D3167 | |
| Mag-Fluo-4AM | ThermoFisher Scientific | M14206 | |
| Acupunture needles | LHASA | TC1.20×13 | |
| 60mL BD syringe with luer-lok | Fisher Scientific | 14-820-11 | |
| LabView | National Instruments | ||
| Speed vacuum Eppendorf Vagufuge | Fisher Scientific | 07-748-13 | |
| Digital signal processing circuit DSP TMS 320 | Texas Instrument | ||
| Longpass Dichroic mirror 567nm | ThorLabs | DMLP567L | |
| Objective 10X NA 0.25 DIN AchromaticFinite Intl Standard Objective | Edmund Optics | Stock# 33-437 | |
| Objective 20X NA 0.40 DIN Achromatic Finite Intl Standard Objective | Edmund Optics | Stock# 33-438 | |
| Longpass colored glass filter 590 nm | ThorLabs | FGL590 | |
| Green Nd-YAG laser 532nm, 500mW | |||
| Micromanipulator for laser | Siskiyou | MX130R | |
| Multimode fiber optic 200µm NA 0.39 | ThorLabs | FT200UMT | |
| LEDs blue | Lumileds | L135-B475003500000 | |
| LEDs green | Lumileds | L135-G525003500000 | |
| Cube beam splitter, non-polarizing | ThorLabs | BS007 | |
| 36" Length, Dovetail Optical Rail | Edmund Optics | 54-402 | |
| 2.5" Width, Dovetail Carrier | Edmund Optics | 54-404 | |
| 0.75" Travel, micrometer stage | Edmund Optics | 37-983 | |
| Dovetail optical rail 3" | ThorLabs | RLA075/M | |
| Dovetail rail carrier 1" | ThorLabs | RC1 | |
| Avalanche photodiode Helix 902 | Digi-Key | HELIX-902-200 | |
| Objective holder XY Translator | ThorLabs | ST1XY-S | |
| Aluminum breadboard 6"x6" | ThorLabs | MB6 | |
| Nexus otpical table 4'x6' | ThorLabs | T46HK | |
| Stainless steel cap screws | ThorLabs | HW-KIT5/M | |
| Acrylic sheet | Home Depot/Lowes | ||
| Sylgard Silicone elastomer kit | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Epoxy gel | Walmart/Home Depot | 2-part 5 min clr 1oz | |
| 21G1.5 Precision glide needle | B-D | 305167 | |
| 23G Precision glide needle | B-D | 305145 | |
| Mounting base, 25mmx75mmx10mm | ThorLabs | BA1/M | |
| Wire shelve posts 36" | Alera | AALESW59PO36SR | |
| Wire shelves | Alera | ALESW582424SR | |
| Post and angle clamp | ThorLabs | SWC/M-P5 | |
| Glass syringe for dye chamber | Wheaton | W851020 | |
| Rubber stopper | Home Science Tools | CE-STOP01C | |
References
- Fabiato, A., Fabiato, F. Contractions induced by a calcium-triggered release of calcium from the sarcoplasmic reticulum of single skinned cardiac cells. J Physiol. 249 (3), 469-495 (1975).
- Mitra, R., Morad, M. A uniform enzymatic method for dissociation of myocytes from hearts and stomachs of vertebrates. Am J Physiol. 249 (5), 1056-1060 (1985).
- Escobar, A. L., et al. Developmental changes of intracellular Ca2+ transients in beating rat hearts. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (3), H971-H978 (2004).
- Ramos-Franco, J., Aguilar-Sanchez, Y., Escobar, A. L. Intact Heart Loose Patch Photolysis Reveals Ionic Current Kinetics During Ventricular Action Potentials. Circ Res. 118 (2), 203-215 (2016).
- Mitra, R., Morad, M. A uniform enzymatic method for dissociation of myocytes from hearts and stomachs of vertebrates. Am J Physiol. 249, H1056-H1060 (1985).
- Fischmeister, R., DeFelice, L. J., Ayer, R. K., Levi, R., DeHaan, R. L. Channel currents during spontaneous action potentials in embryonic chick heart cells. The action potential patch clamp. Biophys J. 46 (2), 267-271 (1984).
- Banyasz, T., Horvath, B., Jian, Z., Izu, L. T., Chen-Izu, Y. Profile of L-type Ca(2+) current and Na(+)/Ca(2+) exchange current during cardiac action potential in ventricular myocytes. Heart Rhythm. 9 (1), 134-142 (2012).
- Apkon, M., Nerbonne, J. M. Characterization of two distinct depolarization-activated K+ currents in isolated adult rat ventricular myocytes. J Gen Physiol. 97 (5), 973-1011 (1991).
- Valverde, C. A., et al. Transient Ca2+ depletion of the sarcoplasmic reticulum at the onset of reperfusion. Cardiovasc Res. 85 (4), 671-680 (2010).
- Valverde, C. A., et al. Phospholamban phosphorylation sites enhance the recovery of intracellular Ca2+ after perfusion arrest in isolated, perfused mouse heart. Cardiovasc Res. 70 (2), 335-345 (2006).
- Escobar, A. L., et al. Role of inositol 1,4,5-trisphosphate in the regulation of ventricular Ca(2+) signaling in intact mouse heart. J Mol Cell Cardiol. 53 (6), 768-779 (2012).
- Mejía-Alvarez, R., et al. Pulsed local-field fluorescence microscopy: a new approach for measuring cellular signals in the beating heart. Pflügers Arch. 445 (6), 747-758 (2003).
- Ferreiro, M., Petrosky, A. D., Escobar, A. L. Intracellular Ca2+ release underlies the development of phase 2 in mouse ventricular action potentials. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302 (5), H1160-H1172 (2012).
- Kornyeyev, D., et al. Calsequestrin 2 deletion shortens the refractoriness of Ca2+ release and reduces rate-dependent Ca2+-alternans in intact mouse hearts. J Mol Cell Cardiol. 52 (1), 21-31 (2012).
- Mattiazzi, A., Argenziano, M., Aguilar-Sanchez, Y., Mazzocchi, G., Escobar, A. L. Ca2+ Sparks and Ca2+ waves are the subcellular events underlying Ca2+ overload during ischemia and reperfusion in perfused intact hearts. J Mol Cell Cardiol. 79, 69-78 (2015).
- Kornyeyev, D., Reyes, M., Escobar, A. L. Luminal Ca(2+) content regulates intracellular Ca(2+) release in subepicardial myocytes of intact beating mouse hearts: effect of exogenous buffers. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 298 (6), H2138-H2153 (2010).
- Wang, Z. G., Fermini, B., Nattel, S. Repolarization differences between guinea pig atrial endocardium and epicardium: evidence for a role of Ito. Am J Physiol. 260, H1501-H1506 (1991).
- Liu, D. W., Gintant, G. A., Antzelevitch, C. Ionic bases for electrophysiological distinctions among epicardial, midmyocardial, and endocardial myocytes from the free wall of the canine left ventricle. Circ Res. 72 (3), 671-687 (1993).
- Litovsky, S. H., Antzelevitch, C. Transient outward current prominent in canine ventricular epicardium but not endocardium. Circ Res. 62 (1), 116-126 (1988).
- Lukas, A. Electrophysiology of Myocardial Cells in the Epicardial, Midmyocardial, and Endocardial Layers of the Ventricle. J Cardiovasc Pharmacol Ther. 2 (1), 61-72 (1997).
- Antzelevitch, C., Fish, J. Electrical heterogeneity within the ventricular wall. Basic Res Cardiol. 96 (6), 517-527 (2001).
- Gomez, A. M. Modulation of electrical heterogeneity by compensated hypertrophy in rat left ventricle. Am J Physiol. 272 (3 Pt 2), H1078-H1086 (1997).
- Efimov, I. R. Innovation in optical imaging: looking inside the heart. Heart Rhythm. 4 (7), 925-926 (2007).
- Boukens, B. J., Efimov, I. R. A century of optocardiography. IEEE Rev Biomed Eng. 7, 115-125 (2014).
- Zhang, H., Iijima, K., Huang, J., Walcott, G. P., Rogers, J. M. Optical mapping of membrane potential and epicardial deformation in beating hearts. Biophysics J. 111 (2), 438-451 (2016).
