Campo locale microscopia a fluorescenza: Imaging segnali cellulari nei cuori Intact
Summary
Nel cuore, eventi molecolari coordinare le funzioni elettriche e contrattili dell'organo. Un insieme di campo fluorescenza tecniche di microscopia locali qui presentati consente la registrazione di variabili cellulari nei cuori intatti. Identificare i meccanismi che definiscono la funzione cardiaca è fondamentale per capire come funziona il cuore in situazioni patologiche.
Abstract
Nel cuore, studi di segnalazione molecolare sono di solito eseguite nei miociti isolati. Tuttavia, molte situazioni patologiche come ischemia e aritmie possono essere pienamente comprese solo a livello organo complesso. Qui, presentiamo la tecnica spettroscopica locale microscopia a campo a fluorescenza (LFFM) che permette la misurazione di segnali cellulari nel cuore intatto. La tecnica si basa sulla combinazione di un cuore perfuso Langendorff e fibre ottiche per registrare segnali fluorescenti. LFFM ha varie applicazioni nel campo della fisiologia cardiovascolare per studiare cuore in condizioni normali e patologiche. variabili cardiaci multipli possono essere monitorati utilizzando indicatori fluorescenti differenti. Questi includono citosolico [Ca 2+], intra-sarcoplasmatico reticolo [Ca 2+] e potenziali di membrana. Le sonde fluorescenti esogeni sono eccitati e la fluorescenza emessa rilevati con tre diverse disposizioni della tecnica LFFM epifluorescenzas presentato in questo articolo. Le differenze centrali tra queste tecniche sono il tipo di sorgente luminosa utilizzata per l'eccitazione e il modo in cui la luce di eccitazione viene modulata. Il LFFM pulsata (PLFFM) utilizza impulsi di luce laser, mentre onda continua LFFM (CLFFM) utilizza la luce laser continuo per l'eccitazione. Infine, diodi emettitori di luce (LED) sono stati usati come sorgente luminosa terzi. Questa disposizione non coerenti è chiamata ad impulsi microscopia a fluorescenza a LED (PLEDFM).
Introduction
Il cuore è l'organo centrale del sistema cardiovascolare. Contrazione del cuore viene avviata da un aumento intracellulare [Ca 2+]. Il rapporto tra eccitabilità elettrica e cambiamenti in intracellulare Ca 2+ stampa è stato storicamente studiato in cellule dissociate enzimaticamente 1, 2. Tuttavia, le cellule cardiache sono elettricamente, metabolicamente e meccanicamente accoppiati 3, 4. Quando isolato, i miociti non sono solo fisicamente disaccoppiati, ma miociti da diversi strati si mescolano durante la dissociazione 5. Inoltre, nonostante gli enormi vantaggi emersi dallo studio delle cellule isolate in condizioni clamp tensione, 6, 7, 8, la natura intrinseca del cuore come un sincizio alwa elettricoys pone la questione di come funzionalmente differenti sono dissociate cellule da quelli presenti nel tessuto 3.
In questo manoscritto, descriviamo i progressi conseguiti nella conoscenza della fisiologia cardiaca mediante l'uso di tecniche di microscopia locale campo fluorescenza (LFFM) nel cuore intatto. LFFM utilizza indicatori fluorescenti per misurare più variabili fisiologiche come citosolico Ca 2+, intra sarcoplasmatico reticolo (SR) Ca 2+ e potenziale di membrana. Queste misure possono essere ottenuti simultaneamente e in collaborazione con la pressione del ventricolo 9, 10, elettrocardiogrammi 9, potenziali d'azione elettrici (AP), le registrazioni corrente ionica e flash fotolisi di composti in gabbia 4, 11. Inoltre, queste misurazioni possono essere ottenute stimolazione cuore intatto a frequenze superiori closer per i tassi fisiologici. Sebbene numerosi articoli 9, 11, 12, 13, 14 sono stati pubblicati dal nostro gruppo utilizzando tecniche LFFM, la presunzione di complessità tecniche associate con questa tecnica ha impedito l'uso massiccio nello studio ex vivo fenomeni fisiologici nel cuore e altri organi.
La tecnica LFFM (Figura 1) è basata su misurazioni epifluorescenza ottenuti utilizzando una fibra ottica multimodale in contatto con il tessuto. Come qualsiasi tecnica di imaging contatto di fluorescenza, la risoluzione ottica dipende dal diametro e l'apertura numerica (NA) della fibra. Un diametro maggiore NA e più piccola della fibra aumenta la risoluzione spaziale delle misurazioni. AN e diametri delle fibre può variare da 0.22 a 0,66 e da 50 micron a 1 mm rispettivamente. Incordonatura la NA migliorerà il rapporto segnale-rumore (S / N) accettando fotoni che arrivano da un angolo solido più ampio. Per agire come dispositivo epifluorescenza, il fascio di luce viene focalizzato nella fibra ottica con una lente asferica o un obiettivo epifluorescenza dove la NA della lente e la partita fibra. Questa corrispondenza massimizza il trasferimento di energia per l'eccitazione e per raccogliere indietro i fotoni emessi dal fluoroforo.
Per eccitare gli indicatori fluorescenti esogeni caricati nel tessuto, diverse fonti di luce e modalità di illuminazione possono essere utilizzati. I nostri studi pionieristici che utilizzano il pulsato campo locale microscopia a fluorescenza 3, 12 (PLFFM) impiegato un laser a basso costo picosecondi (Figura 1a, PLFFM). Questo tipo di sorgente luminosa ha l'enorme vantaggio di eccitare una grande frazione di molecole fluoroforo sotto l'area di illuminazione, senza candeggio sostanzialmente il colorante a causaper il breve impulso durate 12. Inoltre, l'uso di impulsi ultracorti ha permesso di valutare la durata della fluorescenza del colorante 12. La durata della fluorescenza è una proprietà che può essere utilizzato per quantificare la frazione di molecole di colorante legate al Ca 2+. Purtroppo, il jitter temporale degli impulsi e le variazioni di ampiezza di impulso a impulso limitare l'applicazione di questa strategia sperimentale ai casi in cui la variazione di fluorescenza prodotta dal legame al colorante legante è grande.
Continuous Wave (CW) laser sono di solito usati come fonte di illuminazione principale di LFFM (figura 1b, CLFFM). Il raggio laser può illuminare continuamente il tessuto oppure può essere ferroelectrically modulata. La modulazione ferroelettrico del fascio permette la generazione di impulsi di luce microsecondi. Questa modulazione può essere controllato da hardware esterno. Questa procedura non solo riduce drasticamente tha jitter temporale degli impulsi di luce, ma permette anche fasci di diverse lunghezze d'onda di miscelazione. La miscelazione di fasci avviene multiplazione raggi di laser diversi. Di conseguenza, diversi coloranti aventi differenti proprietà spettrali possono essere eccitati per effettuare misurazioni di una serie di variabili fisiologiche, per esempio, Rhod-2 per citosolico Ca 2+, MagFluo4 per intra-SR Ca 2+ e di-8-ANEPPS per potenziale di membrana.
Sebbene laser presentano diversi vantaggi come la sorgente luminosa in LFFM, altri tipi di sorgenti di luce possono essere utilizzati compresi diodi emettitori di luce (LED). In questo caso, la sorgente di luce di eccitazione costituito da un LED InGaN (Figura 1c, PLEDFM). In LED, i fotoni vengono emessi spontaneamente quando elettroni dalla banda di conduzione si ricombinano con fori nella banda di valenza. La differenza con laser a stato solido è che l'emissione non viene stimolato da altri fotoni. Ciò si traduce in un fascio non coerente euna emissione spettrale più ampia per i LED.
Diversi tipi di LED ad alta potenza possono essere utilizzati. Per le registrazioni AP utilizzando Di-8-ANEPPS e Ca 2+ transitori registrati utilizzando Fluo-4 o Mag-Fluo-4, abbiamo utilizzato un LED che ha un'emissione tipica picco a 485 nm (blu) e mezzo larghezza di 20 nm (Figura 1d). Per Ca 2+ transitori registrati con Rhod-2, il LED ha una emissione tipica picco a 540 nm (verde) e mezza la larghezza di 35 nm (Figura 1d). LED emettono in una lunghezza d'onda di banda e quindi richiedono filtri per restringere la propria emissione spettrale. Inoltre, la luce pulsata può essere generata ad una velocità di 1,6 kHz con durata di 20 ms. I LED sono state pulsate con un transistore ad effetto di campo MOSFET di potenza veloce. registrazioni simultanee con differenti indicatori possono essere eseguite da time-multiplexing i LED. Sfortunatamente, la luce emessa dai LED è più difficile mettere a fuoco su una fibra ottica rispetto ad un fascio laser. Così, il principale svantaggio di noiing LED è che i loro profili di emissione hanno spostamenti angolari (± 15 °) rispetto all'asse principale e un ottica ausiliaria devono essere utilizzati per correggerlo.
In tutte le configurazioni ottiche precedentemente descritte, la luce di eccitazione viene riflessa con l'aiuto di uno specchio dicroico. Il fascio viene successivamente focalizzata da una lente asferica e un obiettivo microscopio su una fibra ottica multimodale che è posizionato sul tessuto. Come in qualsiasi disposizione epifluorescenza, lo specchio dicroico serve anche per separare l'eccitazione dalla luce emessa. Lo spettro della luce emessa viaggia indietro attraverso un filtro barriera per rimuovere ogni eccitazione riflessa. Infine, la luce emessa è focalizzato con un obiettivo su un fotorivelatore (Figura 1).
La trasduzione dalla luce a corrente elettrica viene eseguita da fotodiodi a valanga silicio. Questi diodi hanno una risposta veloce e una sensibilità elevata che consente il rilevamento di scarsa luminosità. Ilfotocorrente prodotto dai fotodiodi a valanga può essere amplificato in due modi: un amplificatore di transimpedenza avente un elemento resistivo di retroazione (Figura 1e) o da un integratore per convertire la corrente in una tensione (Figura 1f). Utilizzando il primo approccio, la tensione di uscita è proporzionale alla fotocorrente e la resistenza di feedback. Un tipico esempio di rilevamento resistivo di impulsi laser picosecondi è illustrata nelle figure 2a, 2b e 2c. Pannello 2a illustra l'uscita dell'amplificatore transimpedenza e il pannello 2b mostra un'espansione tempo dell'intervallo indicato con un asterisco (*). Un algoritmo di picco di tracciamento è stato realizzato per rilevare il picco (rosso) e la base (verde) per le risposte fluorescenti 12. La misurazione della fluorescenza di base fornisce informazioni sia della corrente scura del fotodiodo a valanga e le interferenze introdotto da lig ambientHT e accoppiamento elettromagnetico. Una rappresentazione di picchi e basi è mostrato in figura 2c. Questa figura illustra la fluorescenza emessa dal colorante (Rhod-2) legato a Ca 2+ durante il ciclo cardiaco di un cuore che batte pappagallo.
Nel secondo metodo, la tensione di uscita dell'integratore è una funzione della retroazione di corrente e capacitivi (figure 2d, 2e, 2f e). Figura 2f mostra due cicli consecutivi di integrazione: la prima senza illuminazione esterna e la seconda con impulsi luminosi applicati da un LED pulsata. Una descrizione dettagliata è presentato nelle figure 2g e 2h. Questo approccio, sebbene più laboriosa, fornisce una grande S / N per l'assenza di rumore termico nel condensatore di retroazione. Lo strumento comprende una fase di temporizzazione che genera tutto il controllo e multiplazione della luce di eccitazione e comanda l'integrazione headstage e resperiodi et. Questo è di solito eseguita con un circuito di elaborazione del segnale digitale che svolge anche una differenziazione digitale del segnale di uscita integrato calcolando una regressione on-line dei dati. Nel caso di utilizzo di un risposte resistivo, qualsiasi scheda di acquisizione A / D può essere utilizzato.
Infine, la nostra tecnica LFFM è estremamente versatile e può essere adattato per registrare da più di una regione. Aggiunta di un divisore di fascio nel percorso ottico consente di suddividere la luce in due fibre ottiche. Ciascuna fibra ottica può quindi essere posizionato su diverse regioni di un tessuto, in modo indipendente, eccitare ed emissione registrare da sonde fluorescenti esogeni. Questa modifica ci permette di valutare come anatomica differenze regionali influenzano variabili fisiologiche. La figura 3 mostra un divisore di fascio essendo impiegato per dividere la luce di eccitazione CW sono usati in modo tale che due fibre ottiche per misurare transmurale intracellulare elettrico o [Ca 2+] i livelli ingegnoh minore invasività. segnali transmurale possono essere registrati mettendo una fibra sul endocardio e l'altra sullo strato epicardio della parete ventricolare. Pertanto, la tecnica LFFM ha la capacità di misurare l'andamento temporale dei segnali cellulari in diverse regioni e può essere utilizzato per verificare se i cambiamenti regionali verificano in situazioni patologiche.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo documento è centrato nel descrivere le tecniche di campo fluorescenza locali per valutare la funzione dei miociti cardiaci ex vivo. Lo studio di queste cellule in un ambiente accoppiata non solo è più fisiologico, ma è anche molto appropriato per valutare patologie a livello di organo. Gli eventi cellulari sottostanti accoppiamento eccitazione-contrazione (ECC) possono essere valutati a livello organo complesso con l'uso di sonde molecolari che controllano intracellulari Ca 2+ dinamich…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il Dott Alicia Mattiazzi per la discussione critica del lavoro presentato. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione da NIH (R01 HL-084.487) per ALE.
Materials
| Sodium chloride | Sigma | 7647-14-5 | |
| D-(+)-glucose | Sigma | 50-99-7 | |
| Potassium chloride | Sigma | 7447-40-7 | |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | |
| Sodium phosphate | Sigma | 10049-21-5 | |
| Calcium chloride solution | Sigma | 10043-52-4 | |
| Magnesium chloride solution | Sigma | 7786-30-3 | |
| Sodium hyrdoxide | Sigma | S-8045 | |
| 0.2um nylon membrane filter | Whatman | 7402-004 | |
| Manifold MPP | Warner | 64-0216 | |
| 21G1.5 Precision glide needle | B-D | 305167 | |
| Black Braided silk string (non-absorbable surgical suture) | AllMech Tech | LOOK-SP105 | |
| Heparin sodium injection 1000USP/mL | AllMech Tech | NDC63323-540-11 | |
| DMSO D8779 | Sigma | 67-68-5 | |
| Blebbistatin | Sigma | 856925-71-8 | |
| Pluronic F-127 20% solution | Biotium | 59004 | |
| Materflex C/L peristaltic pump | Cole-Parmer | 77122-26 | |
| Isostim stimulator | World Precision Instruments | A320RC | |
| Waveform generator | Teledyne Lecroy | WaveStation 2012 | |
| Ultrasonic cleaner FS20 | Fisher Scientific | 1533530 | |
| Tygon tubing ID:1/32" OD:3/32" Wall 1/32" | Component Supply | TET-031A | |
| Tygon tubing ID:3/32" OD:5/32" Wall 1/32" | Component Supply | TET-094A | |
| Adapter luer lock to 3-way valve | Cole-Parmer | EW-31200-80 | |
| Tee adapters and plastic fittings | Cole-Parmer | 6365-90 | |
| Plastic clamp | WaterZoo | 2465 | |
| Peltier | TE Technology | TE-127-2.0-2.5 | |
| Rhod-2AM | ThermoFisher Scientific | R1245MP | |
| Di-8-ANEPPS | ThermoFisher Scientific | D3167 | |
| Mag-Fluo-4AM | ThermoFisher Scientific | M14206 | |
| Acupunture needles | LHASA | TC1.20×13 | |
| 60mL BD syringe with luer-lok | Fisher Scientific | 14-820-11 | |
| LabView | National Instruments | ||
| Speed vacuum Eppendorf Vagufuge | Fisher Scientific | 07-748-13 | |
| Digital signal processing circuit DSP TMS 320 | Texas Instrument | ||
| Longpass Dichroic mirror 567nm | ThorLabs | DMLP567L | |
| Objective 10X NA 0.25 DIN AchromaticFinite Intl Standard Objective | Edmund Optics | Stock# 33-437 | |
| Objective 20X NA 0.40 DIN Achromatic Finite Intl Standard Objective | Edmund Optics | Stock# 33-438 | |
| Longpass colored glass filter 590 nm | ThorLabs | FGL590 | |
| Green Nd-YAG laser 532nm, 500mW | |||
| Micromanipulator for laser | Siskiyou | MX130R | |
| Multimode fiber optic 200µm NA 0.39 | ThorLabs | FT200UMT | |
| LEDs blue | Lumileds | L135-B475003500000 | |
| LEDs green | Lumileds | L135-G525003500000 | |
| Cube beam splitter, non-polarizing | ThorLabs | BS007 | |
| 36" Length, Dovetail Optical Rail | Edmund Optics | 54-402 | |
| 2.5" Width, Dovetail Carrier | Edmund Optics | 54-404 | |
| 0.75" Travel, micrometer stage | Edmund Optics | 37-983 | |
| Dovetail optical rail 3" | ThorLabs | RLA075/M | |
| Dovetail rail carrier 1" | ThorLabs | RC1 | |
| Avalanche photodiode Helix 902 | Digi-Key | HELIX-902-200 | |
| Objective holder XY Translator | ThorLabs | ST1XY-S | |
| Aluminum breadboard 6"x6" | ThorLabs | MB6 | |
| Nexus otpical table 4'x6' | ThorLabs | T46HK | |
| Stainless steel cap screws | ThorLabs | HW-KIT5/M | |
| Acrylic sheet | Home Depot/Lowes | ||
| Sylgard Silicone elastomer kit | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Epoxy gel | Walmart/Home Depot | 2-part 5 min clr 1oz | |
| 21G1.5 Precision glide needle | B-D | 305167 | |
| 23G Precision glide needle | B-D | 305145 | |
| Mounting base, 25mmx75mmx10mm | ThorLabs | BA1/M | |
| Wire shelve posts 36" | Alera | AALESW59PO36SR | |
| Wire shelves | Alera | ALESW582424SR | |
| Post and angle clamp | ThorLabs | SWC/M-P5 | |
| Glass syringe for dye chamber | Wheaton | W851020 | |
| Rubber stopper | Home Science Tools | CE-STOP01C | |
References
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