Een veelzijdige Montage Methode voor de lange termijn beeldvorming van ontwikkeling van de zebravis
Summary
Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.
Abstract
Zebravisembryo's vormen een ideale experimenteel systeem om complexe morfogenetische processen te bestuderen vanwege hun gemakkelijke toegankelijkheid en optische transparantie. Vooral achterste lichaam rek een essentieel proces in embryonale ontwikkeling waarbij meerdere weefsel vervormingen werken samen om de vorming van een groot deel van de lichaamsas sturen. Om dit proces te observeren door langdurige time-lapse imaging moet een bevestigingstechniek waarmee voldoende steun monsters in de juiste positie te houden gedurende de overbrenging naar de microscoop en verkrijging gebruiken. Daarnaast moet de montage ook voldoende bewegingsvrijheid voor de uitgroei van de achterste lichaamsgebied zonder aantasting van de normale ontwikkeling. Tenslotte moet een zekere veelzijdigheid van de montagewijze beeldvormende worden vrijgemaakt voor diverse imaging setups. Hier presenteren we een bevestigingstechniek voor beeldvorming van de ontwikkeling van achterste lichaam elongation in de zebravis D. rerio. Deze techniek houdt montage embryo zodanig dat de kop en dooierzak regio vrijwel volledig opgenomen in agarose, terwijl de achterste lichaamsgebied te rekken en normaal te ontwikkelen. We zullen zien hoe dit kan worden aangepast voor rechtop, omgekeerd en verticale light-sheet microscopie set-ups. Hoewel dit protocol is gericht op montage embryo's voor beeldverwerking met het achterste lichaam, kan het gemakkelijk worden aangepast voor de live imaging meerdere aspecten van zebravis ontwikkeling.
Introduction
Achterste lichaam rek een essentieel proces in embryonale ontwikkeling van het embryo zich een groot deel van de lichaamsas vormen. Het is een voorbeeld van een complex morfogenetisch proces waardoor meercellige gedrag optreden coördinerend de morfogenese op het niveau van afzonderlijke weefsels genereren. Deze differentiële weefsel vervormingen dan samenwerken om de verlenging van het achterste lichaam te genereren in de hele structuur niveau. Om te begrijpen hoe deze processen worden aangestuurd en gecoördineerd tijdens de ontwikkeling, moeten we in staat zijn om deze processen op verschillende schalen te volgen (dat wil zeggen op het niveau van moleculen, cellen, celpopulaties en weefsels) en deze rechtstreeks verband houden met de morfogenese van de gehele structuur .
Zebravis embryo's zijn ideaal voor imaging achterste lichaam rek als hun optische transparantie en de geringe afmetingen zorgt voor de toepassing van minimaal invasieve licht imaging benaderingen zeer geschikt voor live beeldvorming. 1 Dit werd aangetoond door een aantal recente publicaties die gebleken werpen op achterste lichaam ontwikkeling op moleculair niveau, 2 enkele cellen, 3 en inter-weefsel gedrag, 4 en op het niveau van de celpopulatie en hele organen. 5
Geavanceerde imaging technieken zoals confocale, multi-foton microscopie en selectieve vliegtuig verlichting microscopie (SPIM) worden waardoor de lange termijn beeldvorming van ontwikkelingsprocessen met een verminderde werking van het licht toxiciteit en foto-bleken. Robuuste technieken voor de bevestiging van levende monsters nodig heeft drie doelen: 1) voldoende steun aan de bemonsteringen in de juiste positie te houden gedurende de overbrenging naar de microscoop en tijdens acquisitie, 2) voldoende bewegingsvrijheid van het monster om de uitgroei van het achterste lichaam regio zonder dat zijn normale ontwikwikkeling, en tenslotte 3) een zekere mate van veelzijdigheid van de montage-methode om imaging staan op diverse imaging set-ups.
Dit protocol introduceert een bevestigingstechniek voor het afbeelden van de ontwikkeling van de zebravis D. rerio. Deze techniek houdt montage embryo zodanig dat de kop en dooierzak regio vrijwel volledig opgenomen in agarose, terwijl het achterste lichaamsgebied te rekken en normaal te ontwikkelen. Als zodanig is het ook een geschikte methode voor de lange termijn beeldvorming van andere delen van het lichaam ontwikkelen als agarose maakt beeldvormend standaardfitting beeldvormingstechnieken. Dit protocol demonstreert montage van embryo's in een zijwaartse richting, maar het is ook mogelijk om embryo's in alteratieve oriëntaties monteren. Het zal verder zien hoe u de methode voor het rechtop, omgekeerd en verticale light-sheet microscopie opstellingen aan te passen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Deze montage techniek maakt het mogelijk embryo's nog steeds tijdens de overdracht aan de microscoop en op lange termijn time-lapse imaging experimenten gericht op het volgende achterste lichaam rek bij meerdere lengteschalen worden gehouden. Bovendien is veelzijdig doordat het zorgt voor beeldvorming zowel rechtop en ondersteboven microscopie opstellingen en een suggestie gedaan voor hoe dit verder kan worden aangepast om verticaal georiënteerde SPIM.
Een kritische stap in dit protocol…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Estelle Hirsinger: Core funding from the Institut Pasteur and Agence Nationale de la Recherche (ANR-10-BLAN-121801 DEVPROCESS). Estelle Hirsinger is from the Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS). Benjamin Steventon was funded by the Agence Nationale de la Recherche (ANR- 10-BLAN-121801 DEVPROCESS), then a Roux fellowship (Institut Pasteur) then an AFM-Téléthon fellowship (number 16829). He is now supported by a Wellcome Trust/Royal Society Sir Henry Dale Fellowship.
Materials
| CONSUMABLES | |||
| Glass-bottomed dishes | Mattek | P35-1.5-10-C | 35mm petri dish, 10mm microwell. No. 1.5 cover glass |
| Capillaries for injection needles | Sutter | BF 120-94-10 | We use orosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 cm. However, filament needles are not necessary and most injection standard needles should work. |
| Micro-scalpel | Feather | P-715 | Micro Feather disposable opthalmic scalpel with plastic handle |
| Pasteur Pipettes | 230 mm long | ||
| REAGENTS | |||
| Tricaine | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Low-melting point agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| EQUIPMENT | |||
| Fine forceps | FINE SCIENCE TOOLS GMBH | 11252-30 | Dumont #5 |
| Needle puller | Sutter | P97 | Heating-filament needle puller |
| Binocular dissecting microscope | Leica | S8 Apo |
References
- Graeden, E., Sive, H. Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy. J Vis Exp. (26), e1-e2 (2009).
- Delaune, E. A., François, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. Single-Cell-Resolution Imaging of the Impact of Notch Signaling and Mitosis on Segmentation Clock Dynamics. Dev Cell. 23 (5), 995-1005 (2012).
- Lawton, A. K., et al. Regulated tissue fluidity steers zebrafish body elongation. Development. 140 (3), 573-582 (2013).
- Dray, N., et al. Cell-Fibronectin Interactions Propel Vertebrate Trunk Elongation via Tissue Mechanics. Curr Biol. 23 (14), 1335-1341 (2013).
- Steventon, B., et al. Species tailoured contribution of volumetric growth and tissue convergence to posterior body elongation in vertebrates. Development. 143, 1732-1741 (2016).
- Attili, S., Hughes, S. M. Anaesthetic Tricaine Acts Preferentially on Neural Voltage-Gated Sodium Channels and Fails to Block Directly Evoked Muscle Contraction. PLoS ONE. 9 (8), 103751-103756 (2014).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book, 5th Edition; A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2007).
- Schröter, C., et al. Dynamics of zebrafish somitogenesis. Dev Dyn. 237 (3), 545-553 (2008).
- Megason, S. G. In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy. Methods Mol Biol (Clifton, N.J.). 546, 317-332 (2009).
- Sugiyama, M., et al. Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo. PNAS. 106 (49), 20812-20817 (2009).
