En aptamer-baserede sensor til ucheleret Gadolinium (III)

Summary

The use of polydeoxynucleotide (44-mer aptamer) molecules for sensing unchelated gadolinium(III) ion in an aqueous solution is described. The presence of the ion is detected via an increase in the fluorescence emission of the sensor.

Abstract

A method for determining the presence of unchelated trivalent gadolinium ion (Gd³⁺) in aqueous solution is demonstrated. Gd³⁺ is often present in samples of gadolinium-based contrast agents as a result of incomplete reactions between the ligand and the ion, or as a dissociation product. Since the ion is toxic, its detection is of critical importance. Herein, the design and usage of an aptamer-based sensor (Gd-sensor) for Gd³⁺ are described. The sensor produces a fluorescence change in response to increasing concentrations of the ion, and has a limit of detection in the nanomolar range (~100 nM with a signal-to-noise ratio of 3). The assay may be run in an aqueous buffer at ambient pH (~7 – 7.4) in a 384-well microplate. The sensor is relatively unreactive toward other physiologically relevant metal ions such as sodium, potassium, and calcium ions, although it is not specific for Gd³⁺ over other trivalent lanthanides such as europium(III) and terbium(III). Nevertheless, the lanthanides are not commonly found in contrast agents or the biological systems, and the sensor may therefore be used to selectively determine unchelated Gd³⁺ in aqueous conditions.

Introduction

Den stigende betydning af magnetisk resonans imaging (MRI) i klinisk diagnose, som er begrænset af den iboende følsomhed af teknikken, har resulteret i den hurtige vækst i forskning i udvikling af nye gadolinium-baserede kontrastmidler (GBCAs) ^1. GBCAs er molekyler, der administreres for at forbedre billedkvaliteten, og de har typisk den kemiske struktur af et trivalent gadolinium ion (Gd ³⁺⁾ koordineret til en polydentatligand. Denne kompleksdannelse er af afgørende betydning, da ucheleret Gd ³⁺ er giftigt; det er blevet impliceret i udviklingen af nefrogen systemisk fibrose hos nogle patienter med nyresygdom eller svigt ^2. Derfor, afsløre den vandige fri ion er medvirkende til at sikre sikkerheden for GBCAs. Tilstedeværelsen af ucheleret Gd3 ⁺ i gbca løsninger ofte er resultatet af en ufuldstændig reaktion mellem liganden og ionen, dissociation af komplekset, eller forskydning senst af andre biologiske metalkationer ^3.

Blandt de flere teknikker i øjeblikket anvendes til bestemmelse af tilstedeværelsen af Gd ^3+, der bygger på kromatografi og / eller spektrometri rang højest målt i alsidighed og anvendelighed ^4. Blandt deres styrke er høj følsomhed og nøjagtighed, evnen til at analysere forskellige prøvematricer (herunder humant serum ^5, urin og hår ^6, spildevand ^7, og agent formuleringer kontrast ^8), og den samtidige kvantificering af multiple Gd3 ⁺ komplekser (en notering undersøgelser før 2013 er beskrevet i en omfattende gennemgang af Telgmann et al.) ^4. Den eneste ulempe er, at adskillige af disse metoder kræver instrumentationer (såsom induktivt koblet plasma-massespektrometri) ^4, at nogle laboratorier måske ikke har adgang til. Inden for rammerne af romanen gbca opdagelse på forsknings- og proof-of-concept-niveauer, arelatively mere bekvem, hurtig og omkostningseffektiv spektroskopiske-baserede metode (såsom UV-Vis absorption eller fluorescens) kan tjene som et værdifuldt alternativ. Med disse programmer i tankerne, blev en fluorescerende aptamer-baserede sensor til vandig Gd ³⁺ udviklet ^9.

Aptameren (Gd-aptamer) er en 44-base, lang enkeltstrenget DNA molekyle med en specifik sekvens af baser, der blev isoleret gennem processen med systematisk udvikling af ligander ved eksponentiel berigelse (SELEX) ^9. At tilpasse aptamer til en fluorescerende sensor, er en fluorofor bundet til 5'-terminale ende af strengen, som derefter hybridiseres med en quenching-streng (QS) via 13 komplementære baser (figur 1). QS er tagget med en mørk quencher-molekyle i 3'-terminus. I mangel af Gd3 ^+, sensoren (Gd-sensor), består af en 1: 2 molforhold Gd-aptamer og QS henholdsvis vil have minimal fluorescensemission grund to energioverførsel fra fluoroforen til quencher. Tilsætning af vandig Gd3 ⁺ vil fortrænge QS fra Gd-aptamer, hvilket resulterer i en stigning i fluorescensemission.

Figur 1. Sensoren (Gd-sensor), der består af 44 baser lang aptamer (Gd-aptamer) mærket med fluorescein (a fluorofor) og 13-basen lang quenching streng (QS) tagget med dabcyl (en mørk quencher) . I mangel af ucheleret Gd3 ^+, fluorescensen af sensoren er minimal. Med tilsætning af Gd3 ^+, forskydning af QS forekommer, og der observeres en stigning i fluorescensemission. Klik her for at se en større version af dette tal.

Der er på nuværende tidspunkt, et almindeligt brugt spektroskopiske-metode til at påviseing vandig Gd3 ^+. Dette assay anvender molekylet xylenol orange, som gennemgår en forskydning i den maksimale absorptionsbølgelængde fra 433 til 573 nm ved chelatering til ionen ^10. Forholdet mellem disse to absorbans maksima kan anvendes til at kvantificere mængden af ucheleret Gd3 ^+. Den aptamer sensoren er et alternativ (kan også være et supplement) til xylenol appelsin-analysen, da de to metoder har forskellige reaktionsbetingelser (såsom pH og sammensætningen af ​​bufferopløsninger anvendt), target selektiviteter, lineære intervaller af kvantificering, og afsløring modaliteter ^9.

Protocol

BEMÆRK: molekylærbiologisk kvalitet vand anvendes i alle buffer- og opløsningspræparater. Alle engangsartikler rør (mikrocentrifugerør og PCR) og pipettespidser er DNase- og RNase-fri. Se venligst sikkerhedsdatablad (MSDS) for alle kemikalier før brug. Anvendelse af egnede personlige værnemidler (PPE) anbefales kraftigt. 1. Fremstilling af aptameren Stamopløsninger Køb 2 tråde af polydeoxynukleotid kommercielt. Bestille begge strenge med rensning ved hjælp af højtyden…

Representative Results

En typisk fluorescens ændring af Gd-sensor opløsning i nærvær af ucheleret Gd3 + er vist i figur 2. Emissionen kan afbildes som fluorescens gange ændring (figur 2A) eller den rå fluorescens aflæsning (figur 2B) i arbitrære enheder (AFU). Begge grunde give meget lignende kalibreringskurver med et lineært område for koncentrationer af Gd3 + under 1 uM og mætning af signalet ved> 3 uM. Detektionsgrænsen …

Discussion

Brug af aptamer-baserede Gd-sensor, en stigning i fluorescensemission, der er proportional med koncentrationen af ucheleret Gd3 ⁺ observeres. For at minimere mængden af ​​anvendte prøve kan assayet køres i en 384-brønds mikroplade med en samlet prøvevolumen på 45 pi per brønd. I dette design, blev valget af fluorescein (FAM) og dabcyl (Dab) primært baseret på prisen på reagenserne; at ændre emissionsbølgelængden, en anden parring af fluorofor og quencher kan anvendes ^11.

<p cla…

Materials

Gd-aptamer	IDTDNA	Input sequence and fluorophore modification in the order form	A fluorophore with a different emission wavelength may be used. The aptamer may also be ordered from another company.
Quenching strand	IDTDNA	Input sequence and quencher modification in the order form	A different quencher for optimal energy transfer from the fluorophore may be used. The aptamer may also be ordered from another company.
Molecular biology grade water			No specific manufacturer, both DEPC or non-DEPC treated work equally well
Gadolinium(III) chloride anhydrous	Strem	936416	Toxic
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500
Magnesium chloride anhydrous	MP Biomedicals	0520984480 – 100 g
Sodium Chloride	Acros Organics	327300025
Potassium chloride	Fisher Scientific	P333-500
Sodium hydroxide, pellets	Fisher Scientific	BP359	Corrosive
Hydrochloric acid	Fisher Scientific	SA49	Toxic and corrosive
384-well low flange black flat bottom polystyrene NBS plates	Corning	3575	Plates which are suitable for fluorescence reading are required.
Nalgene Rapid-Flow sterile disposable bottle top filter	Thermo Scientific	5680020	The bottle top is fitted with  0.2 micron PES membrane
Disposable sterile bottles 250 mL	Corning	430281	A larger or smaller bottle may be used
1.5 mL microcentrifuge tubes			No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free
0.2 mL PCR tubes			No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free
Micropipets			No specific manufacturer
Pipet tips (non filter) of appropriate sizes			No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free
Name of Equipment
Plate reader	Biotek Synergy H1		Plate readers from other manufacturers would work equally well