Eencellige Gene Expression Profiling Met behulp van FACS en qPCR met interne standaarden
Summary
We describe a method to sort single mammalian cells and to quantify the expression of up to 96 target genes of interest in each cell. This method includes the use of internal qPCR standards to enable the estimation of absolute transcript counts.
Abstract
Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those populations. Single-cell gene expression measurements can help assess the role of noise in gene expression, identify correlations in the expression of pairs of genes, and reveal subpopulations of cells that respond differently to a stimulus. Here, we describe a procedure to measure the expression of up to 96 genes in single mammalian cells isolated from a population growing in tissue culture. Cells are sorted into lysis buffer by fluorescence-activated cell sorting (FACS), and the mRNA species of interest are reverse-transcribed and amplified. Gene expression is then measured using a microfluidic real-time PCR machine, which performs up to 96 qPCR assays on up to 96 samples at a time. We also describe the generation and use of PCR amplicon standards to enable the estimation of the absolute number of each transcript. Compared with other methods of measuring gene expression in single cells, this approach allows for the quantification of more distinct transcripts than RNA FISH at a lower cost than RNA-Seq.
Introduction
Afzonderlijke cellen in een populatie kan sterk verschillende reacties op een uniforme fysiologische stimulus 1, 2, 3, 4 vertonen. De genetische variatie van cellen in een populatie is één mechanisme voor deze verschillende reacties, maar er zijn ook een aantal niet-genetische factoren die de variabiliteit van de reacties kan verhogen, zelfs in een klonale populatie van cellen. Bijvoorbeeld kan de hoeveelheid melk eiwitten en andere belangrijke signaalmoleculen afhankelijk van een cel per cel basis, hetgeen leidt tot variatie in stroomafwaartse genexpressieprofielen. Bovendien kan genactivatie optreden bij kortdurende uitbarstingen van transcripten 5, 6 die kan worden beperkt tot een relatief klein aantal transcripten per burst 7, 8, 9. zodanigstochasticity in genactivering kan aanzienlijk bijdragen tot variabiliteit in biologische reacties en een selectief voordeel verschaffen in microörganismen 10 en zoogdiercellen 1, 2 reageert op een fysiologische stimulus. Door zowel genetische en niet-genetische bronnen van variatie, kan het genexpressie profiel van elke bepaalde cel in reactie op een stimulus sterk afwijken van de gemiddelde genexpressieprofiel verkregen uit de meting van de massa respons. Vaststelling van de mate waarin individuele cellen geven variabiliteit in reactie op een stimulus vereist technieken voor isolatie van afzonderlijke cellen, het meten van de expressieniveaus van transcripten van belang en de geautomatiseerde analyse van de resulterende expressieplasmide gegevens.
Er zijn verschillende manieren voor het bepalen van genexpressie in enkele cellen, die een breed scala van kosten, het aantal transcripten gesondeerd ennauwkeurigheid van de kwantificering. Bijvoorbeeld eencellige RNA-Seq biedt een grotere scherptediepte transcript dekking en het vermogen om duizenden verschillende transcripten voor de hoogst uitgedrukte genen in individuele cellen te kwantificeren; echter kunnen de kosten voor een dergelijke sequentie diepte onbetaalbaar, maar kosten blijven dalen. Omgekeerd, enkel-molecuul RNA fluorescentie in situ hybridisatie (FISH smRNA) biedt nauwkeurige kwantificering van transcripten voor zelfs low-genen tot expressie tegen een redelijke prijs per gen van belang; echter, kan slechts een klein aantal doelgenen worden getest in een bepaalde cel van deze benadering. Kwantitatieve PCR-gebaseerde testen beschreven in dit protocol, te midden tussen deze technieken. Deze assays maken gebruik van een microfluïdische real-time PCR machine te kwantificeren 96 transcripten plaats in een tijd tot 96 cellen. Terwijl elk van de bovengenoemde methoden heeft hardwarefuncties, de kosten van elke afzonderlijke qPCR assay relatieflaag. Dit protocol is een bewerking van een door een fabrikant van een microfluïdische real-time PCR machine (Protocol ADP 41, Fluidigm) voorgesteld. Om de schatting van het absolute aantal van elke transcript in een PCR-gebaseerde aanpak mogelijk te maken, hebben we het protocol om gebruik te maken van de interne controle van bereide target-gen amplicons die over meerdere experimenten kan worden gebruikt maken uitgebreid.
Als voorbeeld van deze techniek wordt de kwantificering van de expressie van genen gereguleerd door de tumorsuppressor p53 in MCF-7 humane borstcarcinoomcellen 11 beschreven. De cellen worden blootgesteld aan een chemisch agens dat DNA dubbelstrengige breuken induceert. Eerdere studies hebben aangetoond dat de p53 respons op DNA dubbelstrengs breuken vertoont veel heterogeniteit in individuele cellen, zowel wat p53 niveaus 12 en bij de activering van verschillende doelgenen 11. Bovendien p53 regelt de expressie van meer dan 100goed gekarakteriseerde target genen betrokken bij tal stroomafwaartse paden, zoals celcyclus, apoptose, senescentie en 13, 14. Aangezien de p53-gemedieerde respons in elke cel is complex en variabel, de analyse van het systeem beschikt over een benadering waarbij bijna 100 doelgenen kan gelijktijdig geprobed in individuele cellen, zoals hieronder beschreven. Met kleine aanpassingen (zoals alternatieve methoden voor eencellige isolatie en lysis) Het protocol kan gemakkelijk worden aangepast aan een breed scala van zoogdier celtypen, transcripties en cellulaire reacties te bestuderen.
Met een goede voorbereiding vooraf, kan een rondje celsortering en genexpressie metingen worden uitgevoerd volgens dit protocol over een periode van drie dagen. De volgende timing wordt voorgesteld: van tevoren, selecteert u de transcripties van belang, te identificeren en valideren van de primerparen dat de cDNA versterken van die transcrIPTS, en de voorbereiding van de normen en primer mixen met behulp van deze primers. Op dag 1 na celtherapie, oogst en de cellen te sorteren, voert reverse transcriptie en specifieke amplificatie en behandeling van de monsters met een exonuclease om niet opgenomen primers te verwijderen. Op dag 2, het uitvoeren van kwaliteitscontroles op gesorteerde cellen met behulp van qPCR. Tenslotte op dag 3, meet de genexpressie in de cellen gesorteerd met behulp microfluïdische qPCR. Figuur 1 vat de stappen betrokken.
Protocol
Representative Results
Discussion
We hebben voorgesteld een werkwijze voor het isoleren van afzonderlijke zoogdiercellen van een populatie van hechtende cellen gekweekt in kweek en voor het testen van de expressie van ongeveer 96 genen in elke cel. Goede voorbereiding vooraf is essentieel voor deze methode goed te werken. Vooral ontwikkelen en testen primerparen die specifiek zijn voor de transcripten van belang (stap 1,2-1,3) tijdrovend maar belangrijke stappen, zoals de primers bepaalt de kwaliteit van de eencellige metingen. Zodra betrouwbare primerp…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen graag bedanken V. Kapoor in de CCR ETIB Flow Cytometry Core voor haar hulp bij het uitvoeren van de cel sortering tijdens de ontwikkeling van dit protocol. We danken ook M. Raffeld en de CCR LP Moleculaire Diagnostiek Unit en J. Zhu en de NHLBI DNA Sequencing and Genomics Core voor hun hulp bij het uitvoeren van de qPCR tijdens de ontwikkeling van dit protocol. Dit onderzoek werd ondersteund door de Intramurale Program van de NIH.
Materials
| RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor | ThermoFisher | 4374966 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0530S | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Quant-iT High-Sensitivity dsDNA Assay Kit | ThermoFisher | Q33120 | |
| 2.0-mL low adhesion microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1420-2600 | |
| DNA Suspension Buffer | Teknova | T0221 | |
| Axygen 0.2-mL Maxymum Recovery Thin Wall PCR Tubes | Corning | PCR-02-L-C | |
| GE 96.96 Dynamic Array DNA Binding Dye Sample & Assay Loading Reagent Kit | Fluidigm | 100-3415 | |
| HyClone RPMI 1640 media | GE Healthcare Life Sciences | SH30027.01 | |
| Fetal Bovine Serum, Certified (US) | ThermoFisher | 16000-044 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Corning | 30-004-CI | |
| Neocarzinostatin | Sigma | N9162 | |
| ELIMINase | Decon Labs | 1101 | |
| SUPERase-In | ThermoFisher | AM2696 | |
| CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit | ThermoFisher | 11753500 | |
| E. coli DNA | Affymetrix | 14380 10 MG | |
| ThermalSeal Sealing Film, Sterile | Excel Scientific | STR-THER-PLT | |
| BD FACSAria IIu | BD Biosciences | ||
| HyClone Trypsin 0.05% | GE Healthcare Life Sciences | SH30236.01 | |
| PBS, 1x | Corning | 21-040-CV | |
| Falcon 40µm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| Exonuclease I | New England BioLabs | M0293S | |
| SsoFast EvaGreen Supermix with Low ROX | Bio-Rad | 172-5210 | |
| 96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression (microfluidic qPCR chip) | Fluidigm | BMK-M-96.96 | |
| IFC Controller HX (loading machine) | Fluidigm | ||
| BioMark or BioMark HD (microfluidic qPCR machine) | Fluidigm | ||
| Real-Time PCR Analysis software | Fluidigm | ||
| MATLAB software | MathWorks |
References
- Feinerman, O., Veiga, J., Dorfman, J. R., Germain, R. N., Altan-Bonnet, G. Variability and Robustness in T Cell Activation from Regulated Heterogeneity in Protein Levels. Science. 321 (5892), 1081-1084 (2008).
- Spencer, S. L., Gaudet, S., Albeck, J. G., Burke, J. M., Sorger, P. K. Non-genetic origins of cell-to-cell variability in TRAIL-induced apoptosis. Nature. 459 (7245), 428-432 (2009).
- Geva-Zatorsky, N., Rosenfeld, N., et al. Oscillations and variability in the p53 system. Mol. Syst. Biol. 2 (1), (2006).
- Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system. Nature. 437 (7059), 699-706 (2005).
- Chong, S., Chen, C., Ge, H., Xie, X. S. Mechanism of Transcriptional Bursting in Bacteria. Cell. 158 (2), 314-326 (2014).
- Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. Stochastic mRNA Synthesis in Mammalian Cells. PLoS Biol. 4 (10), e309+ (2006).
- Senecal, A., Munsky, B., et al. Transcription Factors Modulate c-Fos Transcriptional Bursts. Cell Rep. 8 (1), 75-83 (2014).
- Dey, S. S., Foley, J. E., Limsirichai, P., Schaffer, D. V., Arkin, A. P. Orthogonal control of expression mean and variance by epigenetic features at different genomic loci. Mol. Syst. Biol. 11 (5), 806+ (2015).
- Dar, R. D., Razooky, B. S., et al. Transcriptional burst frequency and burst size are equally modulated across the human genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (43), 17454-17459 (2012).
- Thattai, M., van Oudenaarden, A. Stochastic gene expression in fluctuating environments. Génétique. 167 (1), 523-530 (2004).
- Porter, J. R., Fisher, B. E., Batchelor, E. p53 Pulses Diversify Target Gene Expression Dynamics in an mRNA Half-Life-Dependent Manner and Delineate Co-regulated Target Gene Subnetworks. Cell Syst. 2 (4), 272-282 (2016).
- Lahav, G., Rosenfeld, N., et al. Dynamics of the p53-Mdm2 feedback loop in individual cells. Nat. Genet. 36 (2), 147-150 (2004).
- Levine, A. J., Oren, M. The first 30 years of p53: growing ever more complex. Nat. Rev. Cancer. 9 (10), 749-758 (2009).
- Riley, T., Sontag, E., Chen, P., Levine, A. Transcriptional control of human p53-regulated genes. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (5), 402-412 (2008).
- Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinf. 13 (1), 134 (2012).
- . . PCR Technologies: A Technical Guide. , (2014).
- Sambrook, J., Russell, D. W. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (2001).
- Batchelor, E., Mock, C. S., Bhan, I., Loewer, A., Lahav, G. Recurrent initiation: a mechanism for triggering p53 pulses in response to DNA damage. Mol. Cell. 30 (3), 277-289 (2008).
- . . Flow Cytometry: Principles and Applications. , (2007).
- . . Real-time PCR. , (2006).
- Song, L., Langfelder, P., Horvath, S. Comparison of co-expression measures: mutual information, correlation, and model based indices. BMC Bioinf. 13 (1), 328 (2012).
- Margolin, A. A., Nemenman, I., et al. ARACNE: An Algorithm for the Reconstruction of Gene Regulatory Networks in a Mammalian Cellular Context. BMC Bioinf. 7 (Suppl 1), (2006).
- Haff, L. A. Improved quantitative PCR using nested primers. PCR Methods Appl. 3 (6), 332-337 (1994).
- Hashimshony, T., Senderovich, N., et al. CEL-Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biol. 17, 77 (2016).
- Ronander, E., Bengtsson, D. C., Joergensen, L., Jensen, A. T. R., Arnot, D. E. Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH). J. Vis. Exp. (68), e4073 (2012).
- Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat. Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
- Lubeck, E., Cai, L. Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling. Nat. Methods. 9 (7), 743-748 (2012).
- Battich, N., Stoeger, T., Pelkmans, L. Image-based transcriptomics in thousands of single human cells at single-molecule resolution. Nat. Methods. 10 (11), 1127-1133 (2013).
