Unicellulare profili di espressione genica Utilizzando FACS e qPCR con standard interni
Summary
We describe a method to sort single mammalian cells and to quantify the expression of up to 96 target genes of interest in each cell. This method includes the use of internal qPCR standards to enable the estimation of absolute transcript counts.
Abstract
Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those populations. Single-cell gene expression measurements can help assess the role of noise in gene expression, identify correlations in the expression of pairs of genes, and reveal subpopulations of cells that respond differently to a stimulus. Here, we describe a procedure to measure the expression of up to 96 genes in single mammalian cells isolated from a population growing in tissue culture. Cells are sorted into lysis buffer by fluorescence-activated cell sorting (FACS), and the mRNA species of interest are reverse-transcribed and amplified. Gene expression is then measured using a microfluidic real-time PCR machine, which performs up to 96 qPCR assays on up to 96 samples at a time. We also describe the generation and use of PCR amplicon standards to enable the estimation of the absolute number of each transcript. Compared with other methods of measuring gene expression in single cells, this approach allows for the quantification of more distinct transcripts than RNA FISH at a lower cost than RNA-Seq.
Introduction
Cellule individuali in una popolazione può mostrare risposte molto diverse ad uno stimolo uniforme fisiologica 1, 2, 3, 4. La variazione genetica di cellule in una popolazione è un meccanismo per questa varietà di risposte, ma ci sono anche diversi fattori non genetici che possono aumentare la variabilità delle risposte, anche in una popolazione clonale delle cellule. Ad esempio, i livelli di singole proteine e di altre importanti molecole di segnalazione possono variare su base cella per cella, dando luogo a variazioni nei profili di espressione genica a valle. Inoltre, l'attivazione del gene può avvenire in esplosioni di breve durata di trascrizioni 5, 6, che può essere limitato ad un numero relativamente piccolo di trascrizioni per raffica 7, 8, 9. Comestocasticità in attivazione del gene può contribuire notevolmente alla variabilità nelle risposte biologiche e in grado di fornire un vantaggio selettivo nei microrganismi 10 e in cellule di mammifero 1, 2 risponde a uno stimolo fisiologico. Grazie alle due fonti genetiche e non genetiche di variazione, il profilo di espressione genica di una data cella in risposta ad uno stimolo può differire notevolmente dal profilo medio espressione genica ottenuti dalla misurazione della risposta bulk. Determinare la misura in cui le singole celle mostrano variabilità in risposta ad uno stimolo richiede tecniche per l'isolamento di singole cellule, la misurazione dei livelli di espressione di trascritti di interesse, e l'analisi computazionale dei dati di espressione risultanti.
Ci sono diversi approcci per saggiare l'espressione genica in cellule singole, che coprono una vasta gamma di costi, il numero di trascrizioni sondato, ela precisione di quantificazione. Ad esempio, monocellulari RNA-Seq offre un'ampia profondità di copertura trascrizione e la capacità di quantificare migliaia di trascritti distinti per i geni più altamente espresso in singole cellule; Tuttavia, il costo associato con tale profondità sequenziamento può essere proibitivo, anche se i costi continuano a diminuire. Al contrario, una sola molecola di RNA ibridazione in situ fluorescente (FISH smRNA) offre una precisa quantificazione di trascritti per anche a bassa espressione dei geni ad un costo ragionevole per ogni gene di interesse; Tuttavia, solo un piccolo numero di geni bersaglio può essere analizzato in una data cella da questo approccio. test basati sulla PCR quantitativa, descritti in questo protocollo, forniscono una via di mezzo tra queste tecniche. Questi test impiegano un real-time PCR macchina microfluidica di quantificare fino a 96 trascrizioni di interesse in un momento in un massimo di 96 celle. Mentre ciascuno dei metodi di cui sopra ha costi hardware necessari, il costo di qualsiasi saggio individuale qPCR è relativamenteBasso. Questo protocollo è adattato da quello suggerito da un produttore di un real-time PCR macchina microfluidica (Protocollo di ADP 41, Fluidigm). Per abilitare la stima del numero assoluto di ogni trascritto in un approccio basato sulla PCR, abbiamo ampliato il protocollo di avvalersi di controlli interni di preparati ampliconi gene bersaglio che possono essere utilizzati in più esperimenti.
Come esempio di questa tecnica, la quantificazione dell'espressione dei geni regolati dal soppressore del tumore p53 in cellule MCF-7 di carcinoma mammario umano è descritto 11. Le cellule sono sfidati con un agente chimico che induce DNA rotture del doppio filamento. Studi precedenti hanno dimostrato che la risposta p53 al DNA rotture del doppio filamento presenta una grande eterogeneità in singole cellule, sia in termini di livelli di p53 12 e nell'attivazione di distinti geni bersaglio 11. Inoltre, p53 regola l'espressione di oltre 100ben caratterizzato geni bersaglio coinvolti in numerose vie a valle, tra cui l'arresto del ciclo cellulare, apoptosi, e senescenza 13, 14. Poiché la risposta p53-mediata in ogni cella è sia complessa e variabile, l'analisi delle prestazioni del sistema da un approccio in cui quasi 100 geni bersaglio può essere sondata simultaneamente in singole cellule, come quello descritto di seguito. Con lievi modifiche (quali metodi alternativi per isolamento cella singola e lisi), il protocollo può essere facilmente adattato per studiare una vasta gamma di tipi di mammiferi, cellule trascrizioni e risposte cellulari.
Con una corretta preparazione anticipata, un giro di smistamento delle cellule e misura l'espressione genica può essere condotta in base a questo protocollo per un periodo di tre giorni. Il seguente tempistica è suggerito: in anticipo, selezionare le trascrizioni di interesse, identificare e convalidare le coppie di primer che amplificano il cDNA da quelli trascrIPTS, e preparare gli standard e le miscele di primer che utilizzano tali primer. Il giorno 1, in seguito al trattamento delle cellule, raccolta e ordinare le celle, eseguire la trascrizione inversa e l'amplificazione target specifico, e trattare i campioni con una esonucleasi per rimuovere primer non incorporati. Il giorno 2, eseguire il controllo di qualità sulle cellule ordinati utilizzando qPCR. Infine, il giorno 3, misurare l'espressione genica nelle cellule ordinati usando microfluidica qPCR. La Figura 1 riassume i passi necessari.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abbiamo presentato un metodo per isolare le singole cellule di mammifero da una popolazione di cellule aderenti in coltura e per saggiare l'espressione di circa 96 geni in ogni cellula. Una buona preparazione anticipo è fondamentale per questo metodo di lavorare bene. In particolare, progettazione e collaudo di primer coppie specifiche per le trascrizioni di interesse (passi 1.2-1.3) sono in termini di tempo, ma importanti passi, come primer determinano la qualità delle misurazioni unicellulari. Una volta coppie d…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare V. Kapoor nel RCC ETIB Citometria a flusso core per il suo aiuto nello svolgere l'ordinamento delle cellule durante lo sviluppo di questo protocollo. Ringraziamo anche M. Raffeld e l'Unità CCR LP diagnostica molecolare e J. Zhu e l'NHLBI sequenziamento del DNA e Genomica core per il loro aiuto nello svolgimento della qPCR durante lo sviluppo di questo protocollo. Questa ricerca è stata sostenuta dal Programma intramurale del NIH.
Materials
| RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor | ThermoFisher | 4374966 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0530S | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Quant-iT High-Sensitivity dsDNA Assay Kit | ThermoFisher | Q33120 | |
| 2.0-mL low adhesion microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1420-2600 | |
| DNA Suspension Buffer | Teknova | T0221 | |
| Axygen 0.2-mL Maxymum Recovery Thin Wall PCR Tubes | Corning | PCR-02-L-C | |
| GE 96.96 Dynamic Array DNA Binding Dye Sample & Assay Loading Reagent Kit | Fluidigm | 100-3415 | |
| HyClone RPMI 1640 media | GE Healthcare Life Sciences | SH30027.01 | |
| Fetal Bovine Serum, Certified (US) | ThermoFisher | 16000-044 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Corning | 30-004-CI | |
| Neocarzinostatin | Sigma | N9162 | |
| ELIMINase | Decon Labs | 1101 | |
| SUPERase-In | ThermoFisher | AM2696 | |
| CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit | ThermoFisher | 11753500 | |
| E. coli DNA | Affymetrix | 14380 10 MG | |
| ThermalSeal Sealing Film, Sterile | Excel Scientific | STR-THER-PLT | |
| BD FACSAria IIu | BD Biosciences | ||
| HyClone Trypsin 0.05% | GE Healthcare Life Sciences | SH30236.01 | |
| PBS, 1x | Corning | 21-040-CV | |
| Falcon 40µm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| Exonuclease I | New England BioLabs | M0293S | |
| SsoFast EvaGreen Supermix with Low ROX | Bio-Rad | 172-5210 | |
| 96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression (microfluidic qPCR chip) | Fluidigm | BMK-M-96.96 | |
| IFC Controller HX (loading machine) | Fluidigm | ||
| BioMark or BioMark HD (microfluidic qPCR machine) | Fluidigm | ||
| Real-Time PCR Analysis software | Fluidigm | ||
| MATLAB software | MathWorks |
References
- Feinerman, O., Veiga, J., Dorfman, J. R., Germain, R. N., Altan-Bonnet, G. Variability and Robustness in T Cell Activation from Regulated Heterogeneity in Protein Levels. Science. 321 (5892), 1081-1084 (2008).
- Spencer, S. L., Gaudet, S., Albeck, J. G., Burke, J. M., Sorger, P. K. Non-genetic origins of cell-to-cell variability in TRAIL-induced apoptosis. Nature. 459 (7245), 428-432 (2009).
- Geva-Zatorsky, N., Rosenfeld, N., et al. Oscillations and variability in the p53 system. Mol. Syst. Biol. 2 (1), (2006).
- Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system. Nature. 437 (7059), 699-706 (2005).
- Chong, S., Chen, C., Ge, H., Xie, X. S. Mechanism of Transcriptional Bursting in Bacteria. Cell. 158 (2), 314-326 (2014).
- Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. Stochastic mRNA Synthesis in Mammalian Cells. PLoS Biol. 4 (10), e309+ (2006).
- Senecal, A., Munsky, B., et al. Transcription Factors Modulate c-Fos Transcriptional Bursts. Cell Rep. 8 (1), 75-83 (2014).
- Dey, S. S., Foley, J. E., Limsirichai, P., Schaffer, D. V., Arkin, A. P. Orthogonal control of expression mean and variance by epigenetic features at different genomic loci. Mol. Syst. Biol. 11 (5), 806+ (2015).
- Dar, R. D., Razooky, B. S., et al. Transcriptional burst frequency and burst size are equally modulated across the human genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (43), 17454-17459 (2012).
- Thattai, M., van Oudenaarden, A. Stochastic gene expression in fluctuating environments. Génétique. 167 (1), 523-530 (2004).
- Porter, J. R., Fisher, B. E., Batchelor, E. p53 Pulses Diversify Target Gene Expression Dynamics in an mRNA Half-Life-Dependent Manner and Delineate Co-regulated Target Gene Subnetworks. Cell Syst. 2 (4), 272-282 (2016).
- Lahav, G., Rosenfeld, N., et al. Dynamics of the p53-Mdm2 feedback loop in individual cells. Nat. Genet. 36 (2), 147-150 (2004).
- Levine, A. J., Oren, M. The first 30 years of p53: growing ever more complex. Nat. Rev. Cancer. 9 (10), 749-758 (2009).
- Riley, T., Sontag, E., Chen, P., Levine, A. Transcriptional control of human p53-regulated genes. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (5), 402-412 (2008).
- Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinf. 13 (1), 134 (2012).
- . . PCR Technologies: A Technical Guide. , (2014).
- Sambrook, J., Russell, D. W. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (2001).
- Batchelor, E., Mock, C. S., Bhan, I., Loewer, A., Lahav, G. Recurrent initiation: a mechanism for triggering p53 pulses in response to DNA damage. Mol. Cell. 30 (3), 277-289 (2008).
- . . Flow Cytometry: Principles and Applications. , (2007).
- . . Real-time PCR. , (2006).
- Song, L., Langfelder, P., Horvath, S. Comparison of co-expression measures: mutual information, correlation, and model based indices. BMC Bioinf. 13 (1), 328 (2012).
- Margolin, A. A., Nemenman, I., et al. ARACNE: An Algorithm for the Reconstruction of Gene Regulatory Networks in a Mammalian Cellular Context. BMC Bioinf. 7 (Suppl 1), (2006).
- Haff, L. A. Improved quantitative PCR using nested primers. PCR Methods Appl. 3 (6), 332-337 (1994).
- Hashimshony, T., Senderovich, N., et al. CEL-Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biol. 17, 77 (2016).
- Ronander, E., Bengtsson, D. C., Joergensen, L., Jensen, A. T. R., Arnot, D. E. Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH). J. Vis. Exp. (68), e4073 (2012).
- Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat. Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
- Lubeck, E., Cai, L. Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling. Nat. Methods. 9 (7), 743-748 (2012).
- Battich, N., Stoeger, T., Pelkmans, L. Image-based transcriptomics in thousands of single human cells at single-molecule resolution. Nat. Methods. 10 (11), 1127-1133 (2013).
