Одноклеточный экспрессии генов профилирование с помощью FACS и КПЦР с внутренними стандартами
Summary
We describe a method to sort single mammalian cells and to quantify the expression of up to 96 target genes of interest in each cell. This method includes the use of internal qPCR standards to enable the estimation of absolute transcript counts.
Abstract
Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those populations. Single-cell gene expression measurements can help assess the role of noise in gene expression, identify correlations in the expression of pairs of genes, and reveal subpopulations of cells that respond differently to a stimulus. Here, we describe a procedure to measure the expression of up to 96 genes in single mammalian cells isolated from a population growing in tissue culture. Cells are sorted into lysis buffer by fluorescence-activated cell sorting (FACS), and the mRNA species of interest are reverse-transcribed and amplified. Gene expression is then measured using a microfluidic real-time PCR machine, which performs up to 96 qPCR assays on up to 96 samples at a time. We also describe the generation and use of PCR amplicon standards to enable the estimation of the absolute number of each transcript. Compared with other methods of measuring gene expression in single cells, this approach allows for the quantification of more distinct transcripts than RNA FISH at a lower cost than RNA-Seq.
Introduction
Отдельные клетки в популяции могут показать сильно различающиеся ответы на единой физиологической стимул 1, 2, 3, 4. Генетическое изменение клеток в популяции является одним механизмом для этого разнообразия ответов, но есть также несколько не-генетические факторы, которые могут увеличить изменчивость реакций, даже в клональной популяции клеток. Например, уровни отдельных белков и других важных сигнальных молекул могут изменяться на основе ячейки за ячейкой, что приводит к изменению в последующих профилей экспрессии генов. Кроме того, активация генов может происходить при кратковременном всплесков транскриптов 5, 6 , которые могут быть ограничены относительно небольшим числом транскриптов в пакете 7, 8, 9. такиестохастич- в активации генов может в значительной степени способствовать вариабельности биологических реакций и может обеспечить селективное преимущество в микроорганизмов 10 и в клетках млекопитающих , 1, 2 в ответ на физиологический стимул. Из-за обоих генетических и негенетическими источников вариации, то профиль экспрессии генов любой данной клетки в ответ на стимул может значительно отличаться от среднего профиля экспрессии генов, полученных из измерения объемной реакции. Определение степени, в которой отдельные клетки показывают изменчивость в ответ на стимул требует методов для выделения отдельных клеток, измерение уровней экспрессии для транскриптов, представляющих интерес, и вычислительный анализ полученных данных экспрессии.
Есть несколько подходов для количественного определения экспрессии генов в единичных клетках, охватывающих широкий диапазон расходов, количество транскриптов зондировали, иТочность количественной оценки. Например, одноклеточные Секвенирование РНК предлагает большой глубины охвата транскрипта и возможность количественно оценить тысячи различных транскриптов для наиболее высоким уровнем экспрессии генов в отдельных клетках; Тем не менее, затраты, связанные с такой глубиной секвенирования может быть непомерно высокой, хотя расходы продолжают снижаться. С другой стороны , одной молекулы РНК флуоресценции в гибридизация (FISH) smRNA в предлагает точную количественную оценку транскриптов для даже с низким уровнем экспрессии генов по разумной стоимости за интерес гена; Тем не менее, лишь небольшое количество генов-мишеней, могут быть проанализированы в данной клетке с помощью этого подхода. Количественные основанные на ПЦР анализы, описанные в данном протоколе, обеспечивают золотую середину между этими методами. Эти анализы используют микрожидком ПЦР в реальном времени машину для количественного определения до 96 транскриптов, представляющих интерес в то время, в срок до 96 ячеек. В то время как каждый из вышеуказанных способов имеет необходимые затраты на оборудование, стоимость любого отдельного КПЦР анализа является сравнительнонизкий. Этот протокол адаптирован из одного предложенной производитель микрожидком ПЦР в реальном времени машины (протокол АДФ 41, Fluidigm). Чтобы включить оценку абсолютного числа каждого транскрипта в подходе ПЦР на основе, мы расширили протокол, чтобы сделать использование внутреннего контроля подготовленных ампликонов гена-мишени, которые могут быть использованы в нескольких экспериментах.
В качестве примера этой техники, количественная оценка экспрессии генов , регулируемых опухолевого супрессора р53 в MCF-7 клетках карциномы молочной железы человека описана 11. Клетки заражали химическим агентом, который индуцирует ДНК двухцепочечной разрывы. Предыдущие исследования показали , что ответ на р53 ДНК двухцепочечной разрывы проявляет большую гетерогенность в отдельных клетках, как с точки зрения уровней p53 12 и в активации различных генов – мишеней 11. Кроме того, р53 регулирует экспрессию более 100хорошо охарактеризованный целевых генов , участвующих в многочисленных последующих путей, в том числе арест клеточного цикла, апоптоз и старении 13, 14. Так как р53-опосредованный ответ в каждой клетке одновременно и сложными и изменчивыми, анализ системных преимуществ от подхода, в котором около 100 генов-мишеней могут быть проверены одновременно в отдельных клетках, таких как описанные ниже. С небольшими изменениями (например, альтернативные методы выделения одноклеточного и лизис), протокол может быть легко адаптирован для изучения широкого спектра типов клеток млекопитающих, транскриптов и клеточных реакций.
При правильной предварительной подготовки, этап сортировки клеток и измерения экспрессии генов может быть проведена в соответствии с этим протоколом в течение периода трех дней. Следующие сроки предлагается: заранее, выберите стенограммы интерес, идентифицировать и проверить пары праймеров, которые усиливают кДНК из этих TranscrДПБ, а также подготовить стандарты и грунтовки смеси с использованием этих праймеров. На 1-й день, после обработки клеток, урожай и сортировки клеток, выполняют обратную транскрипцию и конкретной целевой амплификации, и обрабатывать образцы с экзонуклеазы для удаления некорпоративные праймеров. На 2-й день, осуществлять контроль качества на отсортированных клеток с использованием КПЦР. И, наконец, на 3-й день, измерить экспрессию гена в отсортированных клеток с использованием микрожидкостных КПЦР. На рисунке 1 приведены этапы.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы представили способ выделения отдельных клеток млекопитающих из популяции адгезивных клеток, выращенных в культуре, и будут анализироваться экспрессию приблизительно 96 генов в каждой клетке. Хорошая подготовка заранее имеет решающее значение для этого метода хорошо работать. В ча?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить В. Капур в CCR ETIB проточной цитометрии Ядро для ее помощи в выполнении сортировки клеток во время разработки этого протокола. Мы также благодарим М. Raffeld и блок CCR LP молекулярной диагностики и J. Zhu и НИСЛК секвенирование ДНК и геномики Сердечник за помощь в выполнении КПЦР в процессе разработки этого протокола. Это исследование было поддержано очный программы НИЗ.
Materials
| RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor | ThermoFisher | 4374966 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0530S | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Quant-iT High-Sensitivity dsDNA Assay Kit | ThermoFisher | Q33120 | |
| 2.0-mL low adhesion microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1420-2600 | |
| DNA Suspension Buffer | Teknova | T0221 | |
| Axygen 0.2-mL Maxymum Recovery Thin Wall PCR Tubes | Corning | PCR-02-L-C | |
| GE 96.96 Dynamic Array DNA Binding Dye Sample & Assay Loading Reagent Kit | Fluidigm | 100-3415 | |
| HyClone RPMI 1640 media | GE Healthcare Life Sciences | SH30027.01 | |
| Fetal Bovine Serum, Certified (US) | ThermoFisher | 16000-044 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Corning | 30-004-CI | |
| Neocarzinostatin | Sigma | N9162 | |
| ELIMINase | Decon Labs | 1101 | |
| SUPERase-In | ThermoFisher | AM2696 | |
| CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit | ThermoFisher | 11753500 | |
| E. coli DNA | Affymetrix | 14380 10 MG | |
| ThermalSeal Sealing Film, Sterile | Excel Scientific | STR-THER-PLT | |
| BD FACSAria IIu | BD Biosciences | ||
| HyClone Trypsin 0.05% | GE Healthcare Life Sciences | SH30236.01 | |
| PBS, 1x | Corning | 21-040-CV | |
| Falcon 40µm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| Exonuclease I | New England BioLabs | M0293S | |
| SsoFast EvaGreen Supermix with Low ROX | Bio-Rad | 172-5210 | |
| 96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression (microfluidic qPCR chip) | Fluidigm | BMK-M-96.96 | |
| IFC Controller HX (loading machine) | Fluidigm | ||
| BioMark or BioMark HD (microfluidic qPCR machine) | Fluidigm | ||
| Real-Time PCR Analysis software | Fluidigm | ||
| MATLAB software | MathWorks |
References
- Feinerman, O., Veiga, J., Dorfman, J. R., Germain, R. N., Altan-Bonnet, G. Variability and Robustness in T Cell Activation from Regulated Heterogeneity in Protein Levels. Science. 321 (5892), 1081-1084 (2008).
- Spencer, S. L., Gaudet, S., Albeck, J. G., Burke, J. M., Sorger, P. K. Non-genetic origins of cell-to-cell variability in TRAIL-induced apoptosis. Nature. 459 (7245), 428-432 (2009).
- Geva-Zatorsky, N., Rosenfeld, N., et al. Oscillations and variability in the p53 system. Mol. Syst. Biol. 2 (1), (2006).
- Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system. Nature. 437 (7059), 699-706 (2005).
- Chong, S., Chen, C., Ge, H., Xie, X. S. Mechanism of Transcriptional Bursting in Bacteria. Cell. 158 (2), 314-326 (2014).
- Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. Stochastic mRNA Synthesis in Mammalian Cells. PLoS Biol. 4 (10), e309+ (2006).
- Senecal, A., Munsky, B., et al. Transcription Factors Modulate c-Fos Transcriptional Bursts. Cell Rep. 8 (1), 75-83 (2014).
- Dey, S. S., Foley, J. E., Limsirichai, P., Schaffer, D. V., Arkin, A. P. Orthogonal control of expression mean and variance by epigenetic features at different genomic loci. Mol. Syst. Biol. 11 (5), 806+ (2015).
- Dar, R. D., Razooky, B. S., et al. Transcriptional burst frequency and burst size are equally modulated across the human genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (43), 17454-17459 (2012).
- Thattai, M., van Oudenaarden, A. Stochastic gene expression in fluctuating environments. Génétique. 167 (1), 523-530 (2004).
- Porter, J. R., Fisher, B. E., Batchelor, E. p53 Pulses Diversify Target Gene Expression Dynamics in an mRNA Half-Life-Dependent Manner and Delineate Co-regulated Target Gene Subnetworks. Cell Syst. 2 (4), 272-282 (2016).
- Lahav, G., Rosenfeld, N., et al. Dynamics of the p53-Mdm2 feedback loop in individual cells. Nat. Genet. 36 (2), 147-150 (2004).
- Levine, A. J., Oren, M. The first 30 years of p53: growing ever more complex. Nat. Rev. Cancer. 9 (10), 749-758 (2009).
- Riley, T., Sontag, E., Chen, P., Levine, A. Transcriptional control of human p53-regulated genes. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (5), 402-412 (2008).
- Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinf. 13 (1), 134 (2012).
- . . PCR Technologies: A Technical Guide. , (2014).
- Sambrook, J., Russell, D. W. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (2001).
- Batchelor, E., Mock, C. S., Bhan, I., Loewer, A., Lahav, G. Recurrent initiation: a mechanism for triggering p53 pulses in response to DNA damage. Mol. Cell. 30 (3), 277-289 (2008).
- . . Flow Cytometry: Principles and Applications. , (2007).
- . . Real-time PCR. , (2006).
- Song, L., Langfelder, P., Horvath, S. Comparison of co-expression measures: mutual information, correlation, and model based indices. BMC Bioinf. 13 (1), 328 (2012).
- Margolin, A. A., Nemenman, I., et al. ARACNE: An Algorithm for the Reconstruction of Gene Regulatory Networks in a Mammalian Cellular Context. BMC Bioinf. 7 (Suppl 1), (2006).
- Haff, L. A. Improved quantitative PCR using nested primers. PCR Methods Appl. 3 (6), 332-337 (1994).
- Hashimshony, T., Senderovich, N., et al. CEL-Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biol. 17, 77 (2016).
- Ronander, E., Bengtsson, D. C., Joergensen, L., Jensen, A. T. R., Arnot, D. E. Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH). J. Vis. Exp. (68), e4073 (2012).
- Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat. Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
- Lubeck, E., Cai, L. Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling. Nat. Methods. 9 (7), 743-748 (2012).
- Battich, N., Stoeger, T., Pelkmans, L. Image-based transcriptomics in thousands of single human cells at single-molecule resolution. Nat. Methods. 10 (11), 1127-1133 (2013).
