在这里,我们提出了一个协议,用于人脐带(UC)和胎儿胎盘样品引入帘线衬(CL),脐带胶质(WJ),索胎盘结(CPJ),和胎儿胎盘(FP)为隔离的夹层以及使用该外植体培养技术间充质基质细胞(MSC)的表征。
人类脐带(UC)和胎盘都已经越来越得到重视,因为他们不会造成任何伦理或道德顾虑间充质干细胞(MSCs)的非侵入性的,原始的,来源丰富。目前的方法,从UC隔离的MSC产生低量的具有可变增殖潜能的细胞。由于UC是解剖学-复杂的器官,在MSC性质的差异可能是由于在其分离的解剖区域的差异。在这项研究中,我们首先解剖帘线/胎盘样本分成三个分立的解剖区域:UC,索胎盘结(CPJ),和胎儿胎盘(FP)。第二,两个不同的区域,线衬里(CL)和脐带胶质(WJ),进行分离。然后将外植体培养技术是用于分离从四个来源的细胞。用于从外植体的细胞的原代培养所需要的时间取决于组织的来源而变化。 4哒 – 细胞的生长在3发生所述外植体CPJ的YS,而被后7观察到的生长 – 分别为14天,从CL / WJ和FP外植体, – 10天及11。将分离的细胞粘附于塑料并显示成纤维形态和表面标记,如CD29,CD44,CD73,CD90,和CD105,类似于骨髓(BM) – 衍生的MSC。然而,改变的细胞的集落形成效率,与CPJ-MSC和WJ-MSC的表示比BM-MSC的更高的效率。从所有四个来源的MSCs分化成脂肪细胞,软骨细胞,及成骨细胞系,这表明它们是多能。 CPJ-MSC的,相较于其他的MSC来源更有效地分开。这些结果表明,该CPJ是最有效的解剖区域和产生更高数量的细胞, 在体外增殖更大和自我更新的能力。总之,从四个来源的MSC的比较分析表明,CPJ是MSC的细胞治疗,regenerativ更有前途的源Ë医学和组织工程。
干细胞存在于各种器官和身体的组织。他们拥有的再生潜能和整个人类的生活1,2的跨度体内修复受损组织中发挥重要作用。这尤其是因为已经产生的成体干细胞(ASCs)的极大兴趣,不像胚胎干细胞(ESC),采用的ASC并不构成道德和伦理困境。一些研究报告的ASC,如间充质基质细胞(MSC)的隔离;造血干细胞(HSC);和不同的祖细胞,包括各种成人来源,从骨髓(BM)到脂肪组织(AT)和牙髓3,4,5。然而,在大多数成人龛是有限的,并且本的ASC的数量及其隔离通常涉及具有可能的供体的侵入性和痛苦的过程发病部位。另外,供者年龄和环境压力也可以在确定分离细胞6,7,8的质量和生物活性发挥显著作用。的ASC也体外培养过程中显示有限的增殖和分化潜能。
为了克服当前的ASC这些缺点,新源一直奉行孤立的干细胞。这些努力已经导致了干细胞从围产期来源,包括脐带血,脊髓组织,胎盘和羊水9的隔离。这些来源已经获得的,因为他们很容易和丰富的可用性10,11,12,13注意力。从它们衍生此外,围产期组织可以得到非侵入性,和干细胞是比从成人源14,15分离的ASC更原始的。他们从出生时获得的组织中分离,被认为是在基因组发生了变化最小由于老化和环境压力16。
然而,干细胞从围产期来源的报道特点及其潜在的自我更新和分化千差万别11,17。这可能部分是由于这样的事实:人类脐带(UC)是一个复杂的器官。我们假设,围产期组织的离散区域创建负责的变化和相比于来自非围产期来源的ASC这些干细胞更原始的性质具体龛。这项研究描述帘线/胎盘样品的解剖成三个分立的解剖区域:UC,索胎盘结(CPJ),一个ð胎儿胎盘(FP)。统一通信进一步分解为两个区域:衬线(CL)和沃顿商学院的果冻(WJ)。从CL,WJ,CPJ和FP分离的细胞分析表明,他们都表现出成纤维细胞样形态,表达MSC标志物,但他们在自我更新和分化潜能的差异。相比于UC-和FP-衍生的细胞,使它们更有前途源用于细胞疗法,再生医学和组织工程CPJ来源的细胞表现出增殖和自我更新潜力的更高的速率。
在干细胞研究的最新进展,不仅提高基本发展过程的了解,而且在生物技术,医药,细胞治疗,再生医学和组织工程应用18,19,20使用干细胞提供了充满希望的机会。虽然从早期胚胎中分离胚胎干细胞多能性是最有前途的,他们所面临的技术挑战和道德困境21,22,23。从成年细胞的诱导多能干细胞(iPS细胞)提供了一种选择,但他们也面临着类似的技术和安全问题23。此外,的iPSC可以不是遗传稳定的,或者可以具有发生遗传改变,因此限制了它们的治疗用途。干细胞也被报道在各种产后的那朵起诉和器官。这些的ASC的最常见的来源是骨髓,脂肪和肌肉组织。然而,从产后来源的ASC限制了生长和分化潜能24,25。他们还遭受由于老化和暴露于环境压力,因此并不总是有效的治疗应用26,27,28。这导致我们和其他人来搜索比的ASC更原始干细胞的新来源。
我们已经研究了原始的干细胞来源围产期作为替代的ASC。在这份报告中,我们提供了一个可靠,功能强大且简单的方法来隔离线/胎盘样本人类干细胞。相比于用于的ASC的隔离其他来源和方法,这种方法提供了用于分离大量HIG的有效和非侵入性的方法H-质量的MSCs。它进一步突出与从成人来源如BM的MSC围产期MSC的更高的生长和分化潜能。
该UC附着胎儿胎盘是一个大的器官具有不同的解剖区域,其中包括两个动脉,静脉,CL,和WJ(组织周围的血管)。一些研究报告的MSCs从全软线,中WJ,或胎盘分离,可变生长和分化潜能25,29。然而,迄今为止,还没有研究有效地研究并比较从帘线/胎盘样品的不同解剖区域的细胞。在这里,我们提供的UC,CPJ的解剖一个系统的,简单的方法,并连接FP为MSCs的隔离。我们还表明了全面和简单的协议,通过确定其增殖capabil表征和评估分离细胞的质量伊蒂埃斯,以及他们的自我更新和分化潜能。这种方法是可重复的,并产生了大量的优良品质的MSC。
我们发现,组织片1-2毫米大小的部分消化用市售的胰蛋白酶溶液可再现地产生细胞从外植体,而组织的完全消化成单细胞具有分离的细胞的产率低。然而,一个研究报道,UC的较大的组织外植体大约10毫米大小是最佳的细胞分离30。相反,另一项研究表明,将组织外植体的方法导致了更长的培养周期和细胞的产率较低相比,酶消化法31。在以往的报告中,帘线的治疗用胶原酶II和透明质酸酶,单独或以下的胰蛋白酶组织中,已经进行以分离帘线单元32,33 <sup> 34。不仅存在在培养前的脊髓组织的消化方法变化的很大,也分离的细胞似乎是多相的。更长的时间段恶劣的使用酶的可能降低细胞膜,影响细胞粘附和增殖。该方法的结果表明,部分消化的围产期组织外植体提供的细胞的生长,而不会导致大量的细胞损伤,维持存活力,并且产生更高量的MSC的同质群体的。
而用于细胞从外植体的解剖和隔离该协议是简单的,一些步骤可能被证明是具有挑战性的。首先,通过允许其附着在培养瓶的表面确保外植体的粘附性。这可以通过使用介质的量小,仅覆盖所述组织片段进行培养的第2个小时,然后小心地加入剩余的介质来促进。小号的Econd,限制外植体的数量小于15%T75烧瓶中。件或每瓶太多片之间的空间太小是抑制细胞生长。三,组织块不坚持培养瓶表面后孵育3天后,应转移到新的烧瓶中坚持和培养。第四,组织片待培养应该是免费的细胞碎片,其抑制附着的。五,大块的培养需要更多的媒体,不能提高细胞生长效率。最后,监控外植体培养密切,特别是细胞生长的外观后,由于细胞可迅速成为汇合的并且取决于组织源区分。该技术的一些限制包括缺少在解剖样品的CL,WJ,CPJ和FP分离专门知识;一个小样本大小,从而导致低收率WJ;和需要延迟处理-样品被收集的2-4小时内处理以AVOID在细胞恢复的损失。
金标准为MSCs的特征就是坚持塑料,形成了成纤维细胞的表型,并分化成多种谱系的能力。这些也可用于如由ISCT 35描述限定的MSC通常使用的标准。在这项研究中,从所有四个来源分离细胞粘附于塑料并具有用于MSC标记(CD29,CD44,CD73,CD90,和CD105),但对造血标志物CD45阴性表达阳性表达。此外,他们表达的人类白细胞抗原(HLA)I类,但均为阴性HLA II类。相比的BM-MSC,WJ-和CPJ衍生细胞较高。这些结果与以前的报道一致UC源性MSC 33,36,37,38。此外,我们的结果表明,CL-,WJ-,CPJ-,FP-MSC表达多民族国家效力基因如OCT4,NANOG和SOX2;然而,它们的表达比ES细胞低,如先前所报道的39。这些结果也与先前的研究认为报道多能性标志物在围产期衍生的细胞40表达的协议。有趣的是,据观察,多能标记物的表达在CPJ-MSC的比在从其它来源分离的细胞更高。人们也注意到,UC-MSC的表现出比BM-MSC的41更大的自我更新能力。有趣的是,尽管在表型特征的相似性,从四个来源分离的细胞具有可变CFE值。然而,除了FP-MSC,他们都有比的BM-MSC更好的CFE值。相比所有其他MSC时CPJ间充质干细胞增殖过的最高值CFE和速率。此外,WJ-和CPJ-MSC的显示更高分化潜能比的BM-MSC。 CL-MSC的显示至少分化势成所有三个谱系( 即脂肪细胞,软骨细胞,及成骨),而CPJ-MSC的具有最高的三谱系分化潜能和FP-MSC的所显示的最低脂肪细胞分化的潜能。
总之,我们的结果表明,分离的MSC的数量和质量的帘线/胎盘样品中的四个源之间不同。 CPJ间充质干有更多的增殖能力和更大的自我更新能力。他们也分别在其分化成三系细胞类型有效。由于其低倍增时间,CPJ-MSC的可能是迅速扩大1000倍,用于高通量药物或生物材料的筛选。这些细胞可能是细胞治疗和再生医学的应用更有前途的来源。
The authors have nothing to disclose.
这项研究是由OU-WB ISCRM,奥克兰大学和密歇根头部与脊椎研究所的支持。 N·比雷沃卢和C·麦基从奥克兰大学获得教务长研究生研究奖。我们赞赏S·巴克希审查的手稿。
DMEM with 4500 mg/ml glucose | Invitrogen | 11995065 | |
FBS | Aleken Biologicals | FBSS500 | |
Isobutyl-methylxanthine | Sigma | I5879-250mg | |
Dexamethasone | Sigma | D4902-100mg | |
Insulin | Prospec | CYT-270 | |
Indomethacin | Sigma | I7378-5G | |
TGFβ1 | Prospec | CYT-716 | |
Ascorbic acid | Sigma | A-7631 | |
Ascorbate 2-phosphate | Sigma | A-8960 | |
β-glycerophosphate | Sigma | G-6251 | |
TrypLE | Invitrogen | 50591419 | |
GeneJET RNA purification kit | Thermo Scientific | K0732 | |
DNase | Promega | M6101 | |
iScript kit | Biorad | 1708891 | |
Sso-Advanced Universal SYBR Green Supermix Kit | Biorad | 1725274 | |
4% paraformaldehyde | Affymetrix | 19943 | |
OCT | Thermo Scientific | SH75-125D | |
Oil Red O | American MasterTech Scientific | STORO100 | |
Toluidine blue | Thermo Scientific | S71363 | |
Crystal violet | Sigma | C3886 | |
Alizarin red stain | Thermo Scientific | S25131 | |
APC Mouse anti-Human CD29 | BD Biosciences | 559883 | |
APC Mouse anti-Human CD34 | BD Biosciences | 555824 | |
FITC Mouse anti-Human CD44 | BD Biosciences | 555478 | |
FITC Mouse anti-Human CD45 | BD Biosciences | 555482 | |
APC Mouse anti-Human CD73 | BD Biosciences | 560847 | |
FITC Mouse anti-Human CD90 | BD Biosciences | 561969 | |
APC Mouse anti-Human CD105 | BD Biosciences | 562408 | |
Centrifuge | IEC | 93522M-2 | |
CO2 incubator | Thermo Scientific | Hera Cell 150i | |
Light microscope (LM) | Nikon Instruments Inc. | Olympus | |
Hemacytometer | Thermo Scientific | 0267151B | |
Cryostat | Leica | CM3050 S | |
FACS Canto II and Diva Software | BD Biosciences | Canto II | |
Thermocycler | MJ Research Inc. | PTC-100 | |
Real-Time PCR System | Bio-Rad | CFX96 |