Her presenterer vi en protokoll for disseksjon av human navlestrengen (UC) og føtalt placenta prøven i ledningen foring (CL), Wharton gelé (WJ), ledning-placenta knutepunkt (CPJ), og føtal placenta (FP) for isolering og karakterisering av mesenchymale celler (stromale MSCene) ved hjelp av et utenforliggende kulturteknikk.
Den menneskelige navlestreng (UC) og morkaken er ikke-invasiv, primitive og rikelig kilder til mesenchymale stromale celler (MSC) som i økende grad har fått oppmerksomhet fordi de ikke utgjør noen etiske eller moralske bekymringer. Nåværende metoder for å isolere MSC-er fra UC ga små mengder av celler med variable sprednings potensialer. Siden UC er en anatomisk komplekst organ, kan forskjeller i MSC egenskaper være på grunn av forskjeller i de anatomiske regioner i deres isolasjon. I denne studien vi først dissekert snor / placenta prøver i tre adskilte anatomiske regioner: UC, ledning-placenta junction (CPJ), og føtal placenta (FP). For det andre, to distinkte soner, ledning foring (CL) og Wharton gelé (WJ), ble separert. Den utenforliggende kultur teknikken ble deretter anvendt for å isolere celler fra de fire kilder. Den tid som er nødvendig for den primære kultur av celler fra eksplantatene varieres avhengig av kilden av vevet. Utvekst av cellene oppstod innen i 3 – 4 days av CPJ eksplanter, mens vekst ble observert etter 7 – 10 dager og 11 – 14 dager fra CL / WJ og FP eksplantater, henholdsvis. De isolerte cellene var vedheftende til plast og vises fibroblastoid morfologi og overflatemarkører, så som CD29, CD44, CD73, CD90, CD105 og, på samme måte som benmarg (BM) avledede MSC-er. Imidlertid kolonidannende effektivitet av cellene, varieres, med CPJ-MSCer og WJ-MSC-er som viser høyere effektivitet enn BM-MSC-er. MSC-enheter fra alle fire kilder differensiert i adipogene, chondrogen, og osteogene linjer, noe som indikerer at de var multi. CPJ-MSC differensiert mer effektivt i forhold til andre MSC kilder. Disse resultater antyder at den CPJ er den mest potente anatomisk område og gir den et høyere antall celler, med større spredning og selvfornyelse kapasiteter in vitro. Konklusjonen er at den komparativ analyse av MSC-ene fra de fire kildene indikerte at CPJ er en mer lovende kilde av MSC-ene for celleterapi, regenerativEMEDICINE, og tissue engineering.
Stamceller er tilstede i forskjellige organer og vev i legemet. De har regenererende potensial og spille en viktig rolle i å reparere skadet vev i kroppen hele span av menneskeliv en, to. Dette har generert en stor interesse hos voksne stamceller (ASCs), særlig siden, i motsetning til embryonale stamceller (ESCs), har bruk av ASCs ikke utgjør moralske og etiske dilemmaer. Flere studier har rapportert isoleringen av ASC, slik som mesenchymal stromale celler (MSC-er); hematopoetiske stamceller (HSCs); og forskjellige progenitorceller, innbefattende forskjellige voksne kilder som strekker seg fra benmarg (BM) for å fettvev (AT) og tannpulpa 3, 4, 5. Imidlertid er antallet av ASC som er tilstede i de fleste av de voksne nisjene er begrenset, og deres isolasjon omfatter generelt en invasiv og smertefull prosedyre med mulig donornettstedet sykelighet. I tillegg kunne donatorens alder og miljømessig spennings også spille en betydelig rolle i å bestemme kvaliteten og biologisk aktivitet av de isolerte cellene 6, 7, 8. ASCer viser også begrenset, proliferasjon og differensiering potensial under kultur in vitro.
For å overvinne disse ulempene med dagens ASCs har nye kilder blitt forfulgt for å isolere stamceller. Disse anstrengelser har ført til isoleringen av stamceller fra perinatale kilder, inkludert ledningen blod, ledningen vev, placenta, og fostervann 9. Disse kildene har fått oppmerksomhet på grunn av sin enkle og rikelig tilgjengelighet 10, 11, 12, 13. Videre kan perinatale vev oppnås en ikke invasiv, og stamceller avledet fra disse ermer primitive enn ASCer isolert fra voksne kilder 14, 15. De er isolert fra vev oppnådd ved fødselen og anses å ha gjennomgått minimale forandringer i genomet på grunn av aldring og miljømessige påkjenninger 16.
Men de rapporterte egenskapene av stamceller fra perinatale kilder og deres potensial til å fornye seg selv, så vel som for å differensiere variere vidt 11, 17. Dette kan være delvis på grunn av det faktum at det humane navlestreng (UC) er et sammensatt organ. Vi hypotese at de separate områder av perinatal vev lage spesifikke nisjer som er ansvarlige for de variasjoner og mer primitive natur av disse stamcellene i forhold til ASCer avledet fra ikke-perinatale kilder. Denne studien beskriver disseksjon av ledningen / placenta prøver i tre adskilte anatomiske regioner: UC, ledning-placenta junction (CPJs), end føtalt placenta (FP). UC ble videre deles opp i to soner: ledningen foring (CL) og Wharton Jelly (WJ). Analyse av de isolerte celler fra CL, WJ, CPJ, og FP demonstrert at de oppviste alle fibroblastoid morfologi og uttrykt MSC markører, men de skilte seg i sin selvfornyelse og differensiering potensial. CPJ-avledede celler utviste en høyere hastighet av proliferasjon og selvfornyelse potensial som i forhold til UC- og FP-avledede celler, noe som gjør dem til et mer lovende kilde for celleterapi, regenerativ medisin, og regenerering av vev.
Nylige fremskritt innen stamceller ikke bare forbedret forståelse av grunnleggende utviklingsprosessene, men også gitt lovende muligheter for bruk av stamceller i bioteknologisk, farmasøytisk, celle terapi, regenerativ medisin, og vevsmanipuleringsteknikker for 18, 19, 20. Mens pluripotente ESCs isolert fra tidlige embryoer er den mest lovende, de møter tekniske utfordringer og etiske dilemmaer 21, 22, 23. Induserte pluripotente stamceller (iPSCs) avledet fra voksne celler tilveiebringe en alternativ, men også de står overfor tilsvarende tekniske og sikkerhetsmessige problemer 23. Videre iPSCs kan ikke være genetisk stabile, eller kan ha gjennomgått genetiske forandringer og begrenser således deres terapeutiske anvendelse. Stamceller har også blitt rapportert i en rekke postnatal tissaksøker og organer. Den vanligste kilde til disse ASCer er benmargen, adipose, og muskelvev. Imidlertid har ASCer fra postnatale kilder begrenset vekst og differensiering potensial 24, 25. De lider på grunn av aldring og eksponering for miljømessige påkjenninger og således er ikke alltid virkningsfulle for terapeutiske formål 26, 27, 28. Dette har ført oss og andre til å søke etter nye kilder til stamceller som er mer naivt enn ASCs.
Vi har undersøkt perinatale kilder for primitive stamceller som et alternativ til ASCs. I denne rapporten gir vi en pålitelig, robust og enkel metode for å isolere human-MSC fra ledning / placenta-prøver. I forhold til andre kilder og metoder som brukes for isolering av ASC, gir denne fremgangsmåte en effektiv og ikke-invasiv metode for isolering av store mengder av high-kvalitet MSC. Det fremhever videre den høyere vekst og differensiering potensial av perinatale MSCer forhold til MSC-er fra voksne kilder som BM.
UC feste fosteret til placenta er en stor organ med distinkte anatomiske regioner, inkludert to arterier, en vene, Cl, og WJ (vevet rundt blodkar). Flere studier har rapportert isoleringen av MSCene fra hele ledningen, WJ, eller placenta med variabel vekst og differensiering potensialene 25, 29. Ikke desto mindre, til dags dato ingen studie er effektivt undersøkt, med de cellene fra forskjellige anatomiske regioner av ledningen / placenta prøven. Vi gir her en systematisk og enkel metode for disseksjon av UC, CPJ, og tilkoblet FP for isolering av MSCene. Vi viser også en omfattende og enkel protokoll for å karakterisere og evaluere kvaliteten av de isolerte cellene ved å bestemme deres spredning capabilities, samt deres selvfornyelse og differensiering potensialer. Denne fremgangsmåte er reproduserbar og gir en stor mengde av overlegen kvalitet MSC-er.
Vi har funnet at den partielle oppslutning av vevsstykkene 1-2 mm i størrelse ved anvendelse av en kommersiell trypsinoppløsning reproduserbart overgitt celler fra eksplantatene, mens den fullstendige nedbrytning av vev inn i enkeltceller hadde dårlige utbytter av isolerte celler. Men en studie rapporterte at større vevseksplantater av UC omtrent 10 mm i størrelse var optimal for celleisolasjon 30. Omvendt, en annen studie antydet at den vevseksplantatet metoden resulterte i en lengre syklus kultur og lavere utbytte av celler sammenlignet med enzymkutting metode 31. I tidligere rapporter, vev ved behandling av ledningen med kollagenase II og hyaluronidase, hver for seg eller som følge av trypsin, har blitt utført for å isolere ledningen celler 32, 33 <sup>, 34. Ikke bare er det en stor variasjon i fordøyelses metoder for ledningen vev før dyrking, men også de isolerte celler syntes å være heterogene. Bruken av sterke enzymer for lengre tidsperioder kan degradere cellemembranen, som påvirker celle-adhesjon og spredning. Resultatene av denne fremgangsmåte viste at delvis fordøyd perinatale vevseksplantater tilgjengelig utvekst av celler uten å forårsake omfattende celleskade, vedlikeholdes levedyktighet, og ga høyere mengder homogene populasjoner av MSC-er.
Mens protokollen for disseksjon og isolering av celler fra eksplantatene er enkel, kan noen av trinnene vise seg å være utfordrende. Først sikre eksplantat tilslutning ved at deres festing til overflaten av kulturflaske. Dette kan lettes ved anvendelse av en liten mengde av mediet, bare dekker vevsstykkene for de første 2 timer av kulturen, og deretter forsiktig tilsetning av den resterende medium. Second, begrense antall eksplantater til mindre enn 15 per T75-kolbe. For lite mellomrom mellom de stykker eller for mange deler pr kolbe er hemmende for celleutvekst. Tredje, vevsstykkene som ikke kleber til overflaten av dyrkningskolben, etter 3 dagers inkubering skal overføres til en ny flaske, for tilslutning og dyrking. Fjerde, vevsstykkene å dyrkes bør være fri for cellerester, som inhiberer festing. Femte, dyrking av store stykker krever mer medium og ikke forbedrer celle utvekst effektivitet. Til slutt, overvåke eksplantatet kulturene tett, særlig etter utseendet av celleutvekst, som cellene kan raskt blir sammenflytende og differensiere avhengig av vevskilde. Noen få begrensninger ved teknikken omfatter en mangel på kunnskap i dissekere prøvene for å skille CL, WJ, CPJ, og FP; en liten prøvestørrelse, noe som resulterer i lav WJ utbytte; og forsinkede behandlings-prøvene som er nødvendig for å bli behandlet i løpet av 2-4 timer for samling til avoid et tap i cellegjenvinning.
Gullstandarden for karakterisering av MSCene er evnen til å overholde plastisk, danner det fibroblastiske fenotype, og skille ut flere linjene. Dette er også vanlig anvendte kriterier for å definere MSCer som beskrevet av ISCT 35. I denne studien var celler isolert fra alle fire kilder var vedhengende plast og hadde positive uttrykk for MSC-markører (CD29, CD44, CD73, CD90, og CD105), men negative uttrykk for det hematopoetiske markør CD45. I tillegg er det uttrykt humant leukocyttantigen (HLA) klasse I, men var negative for HLA klasse II. Sammenlignet med BM-MSCer, WJ- og CPJ-avledede celler var høyere. Disse resultatene er i samsvar med tidligere rapporter om UC-avledet MSC 33, 36, 37, 38. I tillegg er våre resultater viste at Cl-, WJ-, CPJ-, FP-MSC uttrykt pluripotens gener som OCT4, Nanog, og SOX2; imidlertid, deres ekspresjon var lavere enn for ESCs, som rapportert tidligere 39. Disse resultatene var også i overensstemmelse med en tidligere undersøkelse som rapporterte ekspresjon av pluripotency markører i perinatal-celler avledet fra 40. Interessant nok ble det observert at ekspresjonen av pluripotent markør var høyere i CPJs-MSC-er enn i celler isolert fra andre kilder. Det ble også lagt merke til at UC-MSC viste større selvfornyelse potensial enn BM-MSC 41. Interessant, til tross for likheten i fenotypiske egenskaper, de celler isolert fra de fire kildene hadde variable CFE-verdier. Men bortsett fra FP-MSC, de alle hadde bedre CFE verdier enn BM-MSC. CPJ-MSCene hadde den høyeste CFE-verdi og hastigheten av proliferasjon sammenlignet med alle andre MSC-er. I tillegg WJ- og CPJ-MSC-er vises høyere differensieringspotensialer enn BM-MSC-er. CL-MSC viste minst differensieringpotensiell inn i alle tre cellelinjer (dvs. adipogene, chondrogen, og osteogene), mens CPJ-MSCene hadde den høyeste trelinjet differensiering potensial og FP-MSCene vises det minste adipogene differensiering potensial.
I konklusjonen, våre resultater viste at kvaliteten og kvantiteten av isolerte MSC skilte mellom de fire kilder i ledningen / placenta prøve. CPJ-MSC hadde mer spredning kapasitet og høyere selvfornyelse potensial. De var også potente i deres differensiering i de trelinjet celletyper. På grunn av deres lave doblingstiden, kan CPJ-MSCer være raskt utvidet 1000 ganger og anvendt for high-throughput medikament eller biomateriale screening. Disse cellene kan være en mer lovende kilde for celleterapi og anvendelser av regenerativ medisin.
The authors have nothing to disclose.
Studien ble støttet av OU-WB ISCRM, Oakland University og Michigan Head and Spine Institute. N. Beeravolu og C. McKee mottatt Provost Graduate Research Award fra Oakland University. Vi setter pris S. Bakshi for gjennomgang av manuskriptet.
DMEM with 4500 mg/ml glucose | Invitrogen | 11995065 | |
FBS | Aleken Biologicals | FBSS500 | |
Isobutyl-methylxanthine | Sigma | I5879-250mg | |
Dexamethasone | Sigma | D4902-100mg | |
Insulin | Prospec | CYT-270 | |
Indomethacin | Sigma | I7378-5G | |
TGFβ1 | Prospec | CYT-716 | |
Ascorbic acid | Sigma | A-7631 | |
Ascorbate 2-phosphate | Sigma | A-8960 | |
β-glycerophosphate | Sigma | G-6251 | |
TrypLE | Invitrogen | 50591419 | |
GeneJET RNA purification kit | Thermo Scientific | K0732 | |
DNase | Promega | M6101 | |
iScript kit | Biorad | 1708891 | |
Sso-Advanced Universal SYBR Green Supermix Kit | Biorad | 1725274 | |
4% paraformaldehyde | Affymetrix | 19943 | |
OCT | Thermo Scientific | SH75-125D | |
Oil Red O | American MasterTech Scientific | STORO100 | |
Toluidine blue | Thermo Scientific | S71363 | |
Crystal violet | Sigma | C3886 | |
Alizarin red stain | Thermo Scientific | S25131 | |
APC Mouse anti-Human CD29 | BD Biosciences | 559883 | |
APC Mouse anti-Human CD34 | BD Biosciences | 555824 | |
FITC Mouse anti-Human CD44 | BD Biosciences | 555478 | |
FITC Mouse anti-Human CD45 | BD Biosciences | 555482 | |
APC Mouse anti-Human CD73 | BD Biosciences | 560847 | |
FITC Mouse anti-Human CD90 | BD Biosciences | 561969 | |
APC Mouse anti-Human CD105 | BD Biosciences | 562408 | |
Centrifuge | IEC | 93522M-2 | |
CO2 incubator | Thermo Scientific | Hera Cell 150i | |
Light microscope (LM) | Nikon Instruments Inc. | Olympus | |
Hemacytometer | Thermo Scientific | 0267151B | |
Cryostat | Leica | CM3050 S | |
FACS Canto II and Diva Software | BD Biosciences | Canto II | |
Thermocycler | MJ Research Inc. | PTC-100 | |
Real-Time PCR System | Bio-Rad | CFX96 |