La riprogrammazione di cellule condizionale Pediatric umana esofageo epiteliali per l'uso in ingegneria dei tessuti e la malattia Investigation
Summary
L'espansione del pediatrici cellule epiteliali umane esofagee che utilizzano riprogrammazione condizionale fornisce gli investigatori con una popolazione paziente-specifici di cellule che possono essere utilizzati per l'ingegneria costrutti esofagei per l'impianto autologo per il trattamento di difetti o lesioni e di fungere da serbatoio per test di screening terapeutici.
Abstract
Identifying and expanding patient-specific cells in culture for use in tissue engineering and disease investigation can be very challenging. Utilizing various types of stem cells to derive cell types of interest is often costly, time consuming and highly inefficient. Furthermore, undesired cell types must be removed prior to using this cell source, which requires another step in the process. In order to obtain enough esophageal epithelial cells to engineer the lumen of an esophageal construct or to screen therapeutic approaches for treating esophageal disease, native esophageal epithelial cells must be expanded without altering their gene expression or phenotype. Conditional reprogramming of esophageal epithelial tissue offers a promising approach to expanding patient-specific esophageal epithelial cells. Furthermore, these cells do not need to be sorted or purified and will return to a mature epithelial state after removing them from conditional reprogramming culture. This technique has been described in many cancer screening studies and allows for indefinite expansion of these cells over multiple passages. The ability to perform esophageal screening assays would help revolutionize the treatment of pediatric esophageal diseases like eosinophilic esophagitis by identifying the trigger mechanism causing the patient’s symptoms. For those patients who suffer from congenital defect, disease or injury of the esophagus, this cell source could be used as a means to seed a synthetic construct for implantation to repair or replace the affected region.
Introduction
ingegneria dei tessuti dell'esofago e esofagite eosinofila (EoE) sono stati al centro della ricerca in molti laboratori nel corso dell'ultimo decennio. Difetti congeniti, come atresia esofagea, si osservano in circa 1 su 4000 nati vivi, che si traduce nello sviluppo incompleto dell'esofago porta alla incapacità di mangiare 1. L'incidenza e la prevalenza di EoE sono in aumento da quando l'identificazione del soggetto malattia nel 1993. L'incidenza di EoE varia 0,7-10 / 100.000 a persona-anno e la prevalenza variava 0,2-43 / 100.000 2. Un nuovo approccio chirurgico interessante per il trattamento a lungo divario atresia esofagea consiste nel generare costrutti di tessuto per l'impianto che utilizza le cellule del paziente. Queste cellule in combinazione con impalcature sintetica genera un costrutto autologo che non richiede immunosoppressione. Alcuni gruppi hanno già iniziato ad indagare negli Stati Unitie di cellule staminali-simili per l'ingegneria tissutale esofageo 3 nonché l'uso di cellule epiteliali dell'esofago nativi per ripopolare mucosa 4 – 7. Malattie che sono presenti in esofago di pazienti pediatrici sono spesso difficili da diagnosticare o studiare senza intervento. Inoltre, utilizzando modelli animali o in vitro immortalati modelli di linee cellulari per le malattie pediatriche come EoE non comprendere l'esatta patogenesi della malattia o differenze specifiche del paziente 8. Pertanto, la capacità di studiare processo patologico di un paziente in vitro per identificare specifici innescare malattie antigeni, valutare meccanismi sottostanti e indagare trattamenti farmacologici sarebbe romanzo e fornire ai medici informazioni che possono aiutare nel trattamento del paziente.
Ci sono stati molti tipi di cellule autologhe o paziente-specifici che sono stati proposti per l'uso in tissue di ingegneria e studiare la patogenesi delle malattie umane. Tuttavia, alcuni di questi tipi cellulari sono limitati nella loro capacità di generare abbastanza cellule di un fenotipo specifico per inizializzare una grande impalcatura o eseguire high throughput studi in vitro. L'utilizzo di cellule staminali pluripotenti o multipotenti è stato l'argomento di discussione di ricerca molto, tuttavia, i limiti e le lacune per l'utilizzo di queste cellule sono stati ben descritti 9. L'uso di cellule staminali embrionali umane è molto dibattuto e presenta molti problemi etici. Soprattutto, queste cellule formano teratomi, che sono simili a un tumore, se non sono differenziati dal loro stato pluripotente prima trasporto loro in un ospite vivente 10. Inoltre, l'uso di cellule staminali embrionali non sarebbe paziente-specifico e potrebbe provocare una risposta allogenico e la necessità di soppressione immunitaria 10. Cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) sono cellule pluripotenti che possonoessere derivato dalle cellule di un paziente. cellule somatiche, come le cellule della pelle, possono essere indotte a uno stato pluripotente utilizzando una varietà di tecniche integrative e non integrative. Queste cellule poi servire come un paziente-specifici fonti di cellule per l'ingegneria tissutale o indagine malattia. L'integrazione di materiale genetico indesiderato in queste cellule è una preoccupazione molti hanno descritto ed anche se le sequenze sono completamente rimossi iPSCs apparire per preservare una "memoria" epigenetica verso il tipo di cellula da cui sono stati ricavati 11. Queste cellule anche formeranno teratomi in vivo se non differenziati prima del trapianto 11. Molti protocolli di differenziazione sono stati indagati concentrandosi su linee dell'epitelio 12, 13, 14, tuttavia, è molto importante notare che i tipi cellulari risultanti alla fine di differenziazione non sono omogenei e oolo possiede una frazione del tipo cellulare di interesse. Questo si traduce in bassa resa e la necessità di purificare il tipo cellulare desiderato. Anche se iPSCs sono una potenziale fonte di cellule specifiche del paziente, il processo per ottenere un tipo di cellula di interesse sia per l'ingegneria dei tessuti o indagine malattia è molto inefficiente.
Cellule epiteliali umane sono state isolate con successo da una varietà sia di tessuti malati e non malati nel corpo umano, inclusi: polmone 15, seno 16, intestino tenue 17, colon 18, vescica 19 e dell'esofago 20. È importante notare che le cellule primarie umane hanno un numero finito di passi in cui il fenotipo viene mantenuta 21, 22. Sfortunatamente, questo significa che il numero di cellule necessarie per indagini di malattia o per la semina un'impalcatura ingegnerizzatoper l'impianto non può essere raggiunto. Pertanto, sono necessarie nuove tecniche per espandere le cellule dei pazienti, pur mantenendo un fenotipo epiteliale. Riprogrammazione condizionale di normali e tumorali cellule epiteliali che utilizzano cellule di alimentazione e inibitore ROCK è stato descritto nel 2012 da Liu et al. 2 3. Questa tecnica è stata utilizzata per espandere le cellule epiteliali cancerose ottenuti da biopsie di cancro alla prostata e al seno utilizzando cellule di alimentazione irradiati, inibitore ROCK e medie riprogrammazione condizionale. L'obiettivo era di generare abbastanza cellule per test in vitro, come lo screening di stupefacenti. Questa tecnica è in grado di espandere cellule epiteliali indefinitamente "riprogrammazione" queste cellule a uno stelo o stato progenitore simile, che è altamente proliferativo. È stato dimostrato che queste cellule sono non tumorigeniche e non possiedono la capacità di formare teratomi 23, 24. Inoltre, nessunanomalie cromosomiche o manipolazioni genetiche erano presenti dopo passaging queste cellule in coltura con questa tecnica 23, 24. Ancora più importante, queste cellule sono in grado di differenziarsi in cellule del tipo nativo di interesse. Pertanto, questa tecnica offre un grande serbatoio di cellule epiteliali paziente-specifiche per le indagini malattie o ingegneria dei tessuti senza necessità di immortalizzazione.
Ottenere tessuto epiteliale da un organo specifico, al fine di studiare i processi di malattia è spesso limitata e non sempre è possibile a causa del rischio del paziente. Per quei pazienti affetti da malattia esofagea o difetti, endoscopica recupero biopsia è un approccio minimamente invasivo per ottenere il tessuto epiteliale che può essere dissociato e condizionatamente riprogrammato per fornire una fonte di cellule indefinita che è specifico per la mucosa dell'esofago che del paziente. Questo permette quindi per gli studi in vitrodelle cellule epiteliali per valutare processi di malattia e lo schermo per potenziali terapie. Un processo di malattia che potrebbero notevolmente beneficiare di questo approccio è esofagite eosinofila, che è stato descritto come malattia allergica dell'esofago 8. Prove allergiche e approcci terapeutici potrebbero essere valutati in vitro utilizzando cellule epiteliali del paziente e questi dati possono poi essere trasmessi al medico curante di sviluppare piani di trattamento individualizzato. La tecnica di riprogrammazione condizionale unitamente ottenere biopsie endoscopiche da pazienti pediatrici offre la possibilità di espandere normali cellule epiteliali dell'esofago indefinitamente da qualsiasi paziente. Questa fonte di cellule potrebbe quindi essere abbinato insieme con l'armatura naturale o sintetica per fornire un paziente-specifica opzione chirurgica dei difetti, malattie o traumi. Avere un numero di cellulare indefinito aiuterebbe ingegnere costrutti esofagee che possiedono una struttura completamente reseededlumen con le cellule epiteliali dell'esofago al fine di contribuire a facilitare la rigenerazione dei tipi di cellule rimanenti.
Protocol
Representative Results
Discussion
I passi più importanti al fine di isolare ed espandere cellule epiteliali dell'esofago da biopsie di pazienti sono: 1) adeguatamente dissociare biopsia del tessuto con la morte delle cellule minimo; 2) garantire inibitore ROCK viene aggiunto al mezzo di coltura cellulare ad ogni cambio medio; 3) Non utilizzare più cellule di alimentazione di quanto raccomandato; 4) mantenere una cultura asettica pulito; e 5) le cellule di passaggio appena prima di raggiungere confluenza.
A causa delle …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to acknowledge Connecticut Children’s Medical Center Strategic Research Funding for supporting this work.
Materials
| Primocin | InVivogen | ant-pm2 | |
| Isopentane | Sigma Aldrich | 277258-1L | |
| Gelatin From Porcine Skin | Sigma Aldrich | G1890-100G | |
| DMEM | Thermofisher Scientific | 11965092 | |
| Cryomold | TissueTek | 4565 | |
| Cryomatrix OCT | Thermofisher Scientific | 6769006 | |
| 15ml Conical Tubes | Denville Scientific | C1017-p | |
| Complete Keratinocyte Serum Free Medium | Thermofisher Scientific | 10724011 | |
| Penicillin Streptomycin | Thermofisher Scientific | 15140122 | |
| Glutamax | Thermofisher Scientific | 35050061 | |
| Insulin Solution | Sigma Aldrich | I9278-5ml | |
| Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
| ROCK Inhibitor (Y-27632) | Fisher Scientific | 125410 | |
| F-12 Medium | Thermofisher Scientific | 11765054 | |
| Fetal Bovine Serum | Denville Scientific | FB5001 | |
| Dispase | Thermofisher Scientific | 17105041 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermofisher Scientific | 25300062 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Thermofisher Scientific | 25200072 | |
| 100mm Dishes | Denville Scientific | T1110-20 | |
| 150mm Dishes | Denville Scientific | T1115 | |
| 50ml Conicals | Denville Scientific | C1062-9 | |
| Phosphate Buffered Saline Tablets | Fisher Scientific | BP2944-100 | |
| 5ml Pipettes | Fisher Scientific | 1367811D | |
| 10ml Pipettes | Fisher Scientific | 1367811E | |
| 25ml Pipettes | Fisher Scientific | 1367811 | |
| 9" Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| NIH 3T3 Cells | ATCC | CRL1658 |
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