Een Aanpasbare Kamer voor het meten van de Cel Migratie
Summary
Dit protocol Gegevens een aanpasbare werkwijze celmigratie als reactie op chemoattractanten die ook kunnen worden gebruikt om de diffusiesnelheid van een geneesmiddel te bepalen uit een polymeermatrix meten.
Abstract
Cel migratie is een essentieel onderdeel van het immuunsysteem, groei en wondgenezing. Celmigratie is een complex proces dat interacties tussen cellen, de extracellulaire matrix en oplosbare en niet oplosbare chemische factoren (bv chemoattractanten) omvat. Standaardwerkwijzen voor het meten van de migratie van cellen, zoals de Boyden kamer assay, werken door het tellen van cellen aan weerszijden van een scheidingswand. Deze technieken zijn gemakkelijk te gebruiken; echter, bieden ze weinig geometrische aanpassing voor verschillende toepassingen. Daarentegen kan microfluïdische inrichtingen worden gebruikt om celmigratie met aanpasbare concentratiegradiënten van oplosbare factoren 1, 2 nemen. Echter, methoden voor het maken van microfluidics gebaseerde testen moeilijk om te leren.
We beschrijven hier een eenvoudige methode om celkweek kamers om celmigratie te meten in respons op chemische concentratiegradiënten. Onze cel migratie kamermethode kunnen verschillende lineaire concentratiegradiënt te creëren om celmigratie te bestuderen voor verschillende toepassingen. Deze methode is relatief eenvoudig te gebruiken en wordt typisch uitgevoerd door studenten.
Het microkanaal kamer werd gecreëerd door het plaatsen van een acryl inzetstuk in de vorm van de uiteindelijke microkanaal kamer tot in een petrischaal. Hierna werd poly (dimethylsiloxaan) (PDMS) bovenop het inzetstuk gegoten. De PDMS werd uitharden en vervolgens werd het inzetstuk verwijderd. Dit liet de creatie van putjes in elke gewenste vorm of grootte. De cellen kunnen vervolgens worden toegevoegd aan de microkanaal kamer en oplosbare middelen kan op een van de putjes toegevoegd door weken een agarose blok in de gewenste stof. De agarose blok wordt toegevoegd aan één van de putjes, en time-lapse beelden kunnen houden met het microkanaal kamer om celmigratie te kwantificeren. Variaties van deze methode kan worden gemaakt voor een bepaalde toepassing, waardoor deze methode higHLY aanpasbaar.
Introduction
In order for vital processes such as wound healing, immune responses, and embryonic development to occur, cell migration must take place. Cell migration involves the interaction between cells and neighboring cells, the extracellular matrix, and soluble chemical cues (attractants or repellants). As an example, in the process of wound healing, fibroblasts play an integral role in fibrogenesis and wound contraction, where the cells are recruited to the site of injury to synthesize collagen in order to form the extracellular matrix3. Numerous mechanisms behind the migration of fibroblasts to a wound site have been studied, and they include different mechanical, physical, electrical, and chemotactic factors4. Fibroblasts respond especially well to different concentration gradients of growth factors. These different growth factors work together to optimize tissue regeneration5. While observing the chemotactic response of fibroblasts to growth factor concentrations, one can study the pattern of directional migration of fibroblasts and how they orient themselves around physical obstacles in order to reach their destination. Therefore, the goals of this study were to first develop a system in which fibroblast growth could be tracked under guidance by physical barriers and to secondly model the growth of fibroblasts as they navigate through the system.
Currently, the Boyden chamber assay is the most widely used system to measure the migration of cells6. The Boyden chamber consists of a two-chamber multi-well plate where each well may contain medium with or without chemoattractants7. A filter membrane provides a porous interface between the two chambers in each well; this creates a barrier so that cells cannot pass through unless it is by active migration. Typically, for the Boyden chamber, a chemoattractant is added to the lower chamber, and the system is allowed to equilibrate to form a gradient between the upper and lower wells4. One problem with the Boyden chamber assay is that steep gradients end up forming along a single axis perpendicular with the surface of the membrane. This causes the difference in the chemoattractant concentration between the upper and lower wells to be a lower than what was originally expected. Due to this constraint, the Boyden chamber assay makes it hard to correlate specific cell responses with particular gradient characteristics, such as the slope and the concentration difference. Without these measurements, it is hard to study multi-gradient signal integration.
To address some of the constraints of the traditional Boyden chamber assay, microfluidic assays have been developed to form customizable concentration gradients1. Standard methods for creating microfluidic systems require clean rooms for lithographic techniques. These techniques can be difficult to learn especially in a standard classroom setting. Thus, we have designed a chamber system for measuring cell migration that can be made without using a clean room. Using our system, the wells of the assay can be adjusted to a preferred size, and a linear concentration gradient of customized slope can be produced. This allows for accurate measurement of chemotaxis from random movement. The design is an inexpensive and easy-to-use system to model cell growth in response to different chemical stimuli.
Protocol
Representative Results
Discussion
Onze microkanaal kamer kan worden gebruikt voor een veelheid aan toepassingen, inclusief het bepalen van de celmigratie als reactie op groeifactoren en chemoattractanten en het meten van de diffusiesnelheid van een geneesmiddel vanuit een polymere matrix. Het is mogelijk om onze microkanaal kamer gebruiken om cellen groeien en plaats een chemoattractant aan een einde van de kamer. De cellen groeien in respons op de chemoattractant en de celmigratie kan worden gekwantificeerd door middel van time-lapse beelden dat om de …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs erkennen Clemson University's Creative Inquiry programma en NSF CBET1254609 voor het verstrekken van financiering voor dit project.
Materials
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Sigma-Aldrich | 761036 | poly(dimethylsiloxane) 2-part kit including silicone elastomer base and silicone elastomer curing agent |
| Acrylic Sheets | US Plastic | 44200 | |
| Disposable Petri Dishes | Falcon | 25373-041 | |
| Fluorescein isothiocyanate–dextran | Sigma-Aldrich | FD20s-100MG | |
| Agarose, Type I, Low EEO | Sigma-Aldrich | A6013-100G | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Fisher Scientific | 11965092 | Cell media components |
| Fetal Bovine Serium | Fisher Scientific | 16000036 | Cell media components |
| Penicillin-streptomycin | Fisher Scientific | 15140148 | Cell media components |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP24384 | |
| EVOS XL Cell Imaging System | Thermo Fisher Scientific | AME3300 | Instrument used for taking time-lapse images |
| Versa LASER | Universal Laser Systems, Inc. | Model number VLS2.30 | Laser cutter used for cutting plastic |
References
- Sia, S. K., Whitesides, G. M. Microfluidic devices fabricated in poly (dimethylsiloxane) for biological studies. Electrophoresis. 24 (21), 3563-3576 (2003).
- Lin, F., et al. Generation of dynamic temporal and spatial concentration gradients using microfluidic devices. Lab Chip. 4 (3), 164-167 (2004).
- Darby, I., Hewitson, T. Fibroblast Differentiation in Wound Healing and Fibrosis. Int Rev Cytol. 257, 143-179 (2007).
- Thampatty, B. P., Wang, J. H. -. C. A new approach to study fibroblast migration. Cell Motil Cytoskel. 64, 1-5 (2007).
- Discher, D., Mooney, D., Zandstra, P. Growth Factors, Matrices, and Forces Combine and Control Stem Cells. Science. 324, 1673-1677 (2009).
- Zengel, P., et al. µ-Slide Chemotaxis: A new chamber for long-term chemotaxis studies. BMC Cell Biol. , (2011).
- Chen, H. Boyden Chamber Assay. Methods Molec Biol. 2, 15-22 (2005).
- Safferling, K., et al. Wound healing revised: A novel reepithelialization mechanism revealed by in vitro and in silico models. JCB. 203 (4), 691-709 (2013).
- Saadi, W., et al. Generation of stable concentration gradients in 2D and 3D environments using a microfluidic ladder chamber. Biomed Microdevices. 9, 627-635 (2007).
- Cammer, M., Cox, D. Chemotactic Responses by Macrophages to a Directional Source of a Cytokine Delivered by a Micropipette. Methods Mol Biol. , 125-135 (2014).
- Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. A new direct-viewing chemotaxis chamber. J Cell Sci. 99 (4), 769-775 (1991).
- Wells, C. M., Ridley, A. J. Analysis of cell migration using the Dunn chemotaxis chamber and time-lapse microscopy. Methods Mol Biol. , 31-41 (2005).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat. Protoc. 2, 329-333 (2007).
- Chen, Y. C., et al. Single-cell migration chip for chemotaxis-based microfluidic selection of heterogeneous cell populations. Sci. Rep. 5, (2015).
- Wright, G. A., et al. On-chip open microfluidic devices for chemotaxis studies. Microsc. Microanal. 18 (04), 816-828 (2012).
- Adler, M., Polinkovsky, M., Gutierrez, E., Groisman, A. Generation of oxygen gradients with arbitrary shapes in a microfluidic device. Lab Chip. 10 (3), 388-391 (2010).
- Huang, Y., Agrawal, B., Sun, D., Kuo, J. S., Williams, J. C. Microfluidics-based devices: New tools for studying cancer and cancer stem cell migration. Biomicrofluidics. 5 (1), 013412 (2011).
- Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic chambers for cell migration and neuroscience research. Microfluid Tech: Rev Protoc. , 167-177 (2006).
- Tang, S. K., Whitesides, G. M., Fainman, Y., Lee, L., Psaltis, D., Yang, C. . Basic microfluidic and soft lithographic techniques. Optofluidics: Fundamentals, Devices and Applications. , (2010).
- Taylor, A. M., et al. Microfluidic multicompartment device for neuroscience research). Langmuir. 19 (5), 1551-1556 (2003).
- Aidelberg, G., Goldshmidt, Y., Nachman, I. A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains. JoVE. (69), (2012).
