Intracellulaires Coloration et cytométrie de flux pour identifier lymphocytaires sous-ensembles au sein murin Aorte, Reins et les ganglions lymphatiques dans un modèle de l'hypertension
Summary
Cet article fournit une méthodologie détaillée pour identifier et quantifier les sous-ensembles de lymphocytes T fonctionnels présents dans les ganglions rénaux murin, l'aorte et lymphatiques par coloration intracellulaire et cytométrie de flux. Le modèle de l'angiotensine II hypertension induite a été choisi pour expliquer, étape par étape, les procédures et les principes fondamentaux de la cytométrie de flux et de coloration intracellulaire.
Abstract
It is now well known that T lymphocytes play a critical role in the development of several cardiovascular diseases1,2,3,4,5. For example, studies from our group have shown that hypertension is associated with an excessive accumulation of T cells in the vessels and kidney during the development of experimental hypertension6. Once in these tissues, T cells produce several cytokines that affect both vascular and renal function leading to vasoconstriction and sodium and water retention1,2. To fully understand how T cells cause cardiovascular and renal diseases, it is important to be able to identify and quantify the specific T cell subsets present in these tissues. T cell subsets are defined by a combination of surface markers, the cytokines they secrete, and the transcription factors they express. The complexity of the T cell population makes flow cytometry and intracellular staining an invaluable technique to dissect the phenotypes of the lymphocytes present in tissues. Here, we provide a detailed protocol to identify the surface and intracellular markers (cytokines and transcription factors) in T cells isolated from murine kidney, aorta and aortic draining lymph nodes in a model of angiotensin II induced hypertension. The following steps are described in detail: isolation of the tissues, generation of the single cell suspensions, ex vivo stimulation, fixation, permeabilization and staining. In addition, several fundamental principles of flow cytometric analyses including choosing the proper controls and appropriate gating strategies are discussed.
Introduction
Des données récentes démontrent que le système immunitaire adaptatif, en particulier les lymphocytes T jouent un rôle crucial dans le développement de plusieurs maladies cardiovasculaires 1,2,3,4,5. Par exemple, dans le modèle de l' angiotensine II , l' hypertension induite par une accumulation de lymphocytes T dans les vaisseaux et les reins de souris a été décrite 6. L'accumulation vasculaire est principalement dans l'adventice et la graisse périvasculaire. Dans le rein, les cellules T accumulent à la fois dans la moelle et le cortex rénal. Selon le type de sous – ensemble est en cause, ces cellules T donnent naissance à différentes cytokines qui peuvent affecter la fonction vasculaire et rénale et conduire au développement de la pathologie (revue par McMaster et al. 6).
Lymphocytes T auxiliaires CD4 + peuvent être divisés en plusieurs sous – ensembles: T helper 1 (Th1), Th2, Th9, Th17, TH22, (Treg) T régulatrices, et T helper folliculaire (TFH) des cellules en fonction de leurs fonctions et signature cytokines 7. De même, les cellules T cytotoxiques CD8 + peuvent être classés comme Tc1, Tc2, TC17 ou 8 TC9. Il existe également des cellules T doubles négatives ( par exemple des cellules qui ne manifestent pas les marqueurs CD4 ou des lymphocytes T CD8). Un sous-ensemble de ces cellules possèdent un récepteur alternatif gamma delta T cellulaire (au lieu des récepteurs alpha et bêta classiques) et sont donc appelées cellules T gamma delta. L'analyse multi-paramètres par cytométrie de flux de marqueur de surface, cytokine et facteur de transcription constitue la meilleure approche pour identifier ces cellules. Bien que cette méthode est largement utilisée dans le domaine de l'immunologie, il est moins bien décrite dans les organes solides et dans le cadre des maladies cardiovasculaires.
Dans le passé, l'identification des lymphocytes dans les tissus a été limitée à l'immunohistochimie ou des approches de RT-PCR. Bien que immunohistochimie et immunofluorescence des procédés puissants afin de déterminer la distribution tissulaire d'un antigène d'intEREST, ils sont insuffisants pour identifier les sous-ensembles phénotypique impliqués. En outre, alors que l'analyse par RT-PCR permet de détecter l'expression des ARNm des antigènes, des cytokines ou des facteurs de transcription, elle ne permet pas la détection de protéines multiples simultanément au niveau des cellules individuelles.
L'avènement de la cytométrie en flux, en particulier lorsqu'elle est combinée avec la coloration intracellulaire pour détecter des cytokines et des facteurs de transcription, donne des chercheurs ayant une puissante technique qui permet l'identification et la quantification au niveau de la cellule unique de sous-ensembles de cellules immunitaires dans des organes solides. Nous avons optimisé un essai de coloration intracellulaire pour identifier par cytométrie de flux les principaux sous-ensembles de cellules T présents dans le rein de souris, l'aorte et l'aorte ganglions lymphatiques drainant dans un modèle de l'angiotensine II, l'hypertension induite. L'optimisation de chaque étape: la digestion du tissu, ex vivo activation, perméabilisation, et la surface et les résultats de coloration intracellulaire dans un très nouveauproductible dosage qui peut être appliqué à d'autres modèles de maladies cardiovasculaires et rénales.
Protocol
Representative Results
Discussion
The protocol described herein has been optimized to properly identify T cell subsets present within murine kidneys, aorta and lymph nodes. This protocol can be easily adapted to examine other immune cell subsets such as B lymphocytes and innate immune cells and can be modified to include other tissue types. The digestion step is critical and has to be modified and optimized for each tissue9. A prolonged digestion step or the use of an inappropriate enzyme can affect the stability of antigen expression. Similar…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par un prix de l'American Heart Association Fellowship (16POST29950007) FL, une bourse de formation de la National Institutes of Health (NIH T32 HL069765) à BLD, un prix de l'Association Fellowship American Heart (14POST20420025) à MA Saleh, et une NIH K08 prix (HL121671) au MSM. MSM est également soutenu par une subvention de Gilead Sciences, Inc. recherche
Materials
| Collagenase D | ROCHE | 11088882001 | |
| Collagenase A | ROCHE | 10103586001 | |
| Collagenase B | ROCHE | 11088815001 | |
| Dnase | ROCHE | 10104159001 | |
| 1X Red blood cell lysis buffer | eBioscience | 00-4333-57 | |
| RPMI Medium 1614 1X | Gibco | 11835-030 | |
| DPBS without calcium and magnesium | Gibco | 14190-144 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-5445-02 | For density gradient centrifugation |
| GentleMACS ™ C tube | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| GentleMACS dissociator device | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Use the program SPLEEN_04 |
| Cell activation cocktail (with Brefeldin A) | Biolegend | 423303 | |
| anti-CD16/32 | eBioscience | 14-0161-81 | dilute 1:100 |
| LIVE/DEAD fixable violet dead cell stain kit | Life Technologies | L34955 | |
| Transcription factor buffer set | BD Pharmingen | 562725 | |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111-42 | |
| 123 count eBeads | eBioscience | 01-1234-42 | |
| CD45 AmCyan (clone 30-F11) | BioLegend | 103138 | |
| CD3 PerCP-Cy5.5 (clone 17A2) | BioLegend | 100218 | |
| IL-17A FITC (clone TC11-18H10.1) | BioLegend | 506910 | |
| IL-17F APC (clone 9D3.1C8) | BioLegend | 517004 | |
| CD4 APC-Cy7 (clone GK1.5) | BD Biosciences | 560181 | |
| CD8 APC (clone 53-67) | eBioscience | 17-0081-82 | |
| T-bet PE-Cy7 (clone 4B10) | BioLegend | 644823 | |
| IFNγ FITC (clone XMG1.2) | BD Biosciences | 557724 |
References
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