תאיים מכתים cytometry זרימה לזהות לימפוציטים קבוצות משנה בתוך Murine אבי העורקים, כליות בלוטות לימפה מודל של יתר לחץ דם
Summary
מאמר זה מספק מתודולוגיה מפורט לזהות ולכמת תת T לימפוציטים תפקודית נוכח בתוך הכליה בעכברים, אבי העורקים ובלוטות לימפה על ידי מכתים תאיים cytometry הזרימה. המודל של יתר לחץ דם הנגרמת אנגיוטנסין II נבחר להסביר, צעד אחר צעד, את הנהלים ואת עקרונות יסוד של cytometry זרימה מכתים תאי.
Abstract
It is now well known that T lymphocytes play a critical role in the development of several cardiovascular diseases1,2,3,4,5. For example, studies from our group have shown that hypertension is associated with an excessive accumulation of T cells in the vessels and kidney during the development of experimental hypertension6. Once in these tissues, T cells produce several cytokines that affect both vascular and renal function leading to vasoconstriction and sodium and water retention1,2. To fully understand how T cells cause cardiovascular and renal diseases, it is important to be able to identify and quantify the specific T cell subsets present in these tissues. T cell subsets are defined by a combination of surface markers, the cytokines they secrete, and the transcription factors they express. The complexity of the T cell population makes flow cytometry and intracellular staining an invaluable technique to dissect the phenotypes of the lymphocytes present in tissues. Here, we provide a detailed protocol to identify the surface and intracellular markers (cytokines and transcription factors) in T cells isolated from murine kidney, aorta and aortic draining lymph nodes in a model of angiotensin II induced hypertension. The following steps are described in detail: isolation of the tissues, generation of the single cell suspensions, ex vivo stimulation, fixation, permeabilization and staining. In addition, several fundamental principles of flow cytometric analyses including choosing the proper controls and appropriate gating strategies are discussed.
Introduction
עדויות עדכניות מוכיחות כי המערכת החיסונית אדפטיבית, במיוחד לימפוציטים מסוג T, לשחק תפקיד קריטי בהתפתחות של מחלות לב וכלי דם כמה 1,2,3,4,5. לדוגמא, במודל של יתר לחץ דם נגרמת השני אנגיוטנסין, הצטברות של תאי T על כלי דם הכליות של עכברים תוארה 6. ההצטברות של כלי הדם היא בעיקר בארצות adventitia ואת שומן perivascular. בכליה, תאי T להצטבר הן לשד ואת קליפת הכליה. תלוי באיזה משנה מעורב, תאי T אלו מעוררים ציטוקינים שונים שיכולים להשפיע על תפקוד כלי הדם ואת הכליות ואת להוביל להתפתחות של הפתולוגיה (נבדקה על ידי מקמאסטר et al. 6).
לימפוציטים עוזר CD4 + T ניתן לחלק תת כמה: 1 T מסייעים (Th1), Th2, Th9, TH17, Th22, הרגולציה T (Treg) תאים, עוזר הזקיקים T (TFH) תאים בהתבסס על תפקידיהם ציטומגלווירוס חתימהkines 7. באופן דומה, CD8 + T ציטוטוקסיים תאים ניתן לסווג Tc1, Tc2, Tc17 או Tc9 8. יש גם תאי T כפולים והפוכים (תאים כלומר אינו מבטאים את CD4 או CD8 סמני תא T). תת-קבוצה קטנה של תאים אלה יש קולטן תא T דלתא גמא חלופי (במקום קולטני אלפא ובטא קלאסית) ולכן מכונים תאי T דלתא גמא. הניתוח הרב-פרמטר ידי cytometry זרימת סמן משטח, ציטוקינים ו גורם שעתוק מהווה את הגישה הטובה ביותר כדי לזהות תאים אלה. אמנם שיטה זו נעשתה שימוש נרחב בתחום האימונולוגיה, היא מתוארת פחות טובה באיברים מוצקים על הרקע של מחלות לב וכלי דם.
מבחינה היסטורית, זיהוי של לימפוציטים ברקמות הוגבל אימונוהיסטוכימיה או גישות RT-PCR. למרות אימונוהיסטוכימיה ו immunofluorescence שיטות רבות עצמה כדי לקבוע את חלוקת הרקמות של אנטיגן של interest, הם אינם מספיקים phenotypically לזהות תת מעורב. בנוסף, בעוד ניתוח RT-PCR שימושי כדי לזהות ביטוי mRNA של אנטיגנים, ציטוקינים או גורמי שעתוק, היא אינה מאפשרת זיהוי של חלבונים מרובים בו זמנית ברמה של תאים בודדים.
הופעתו של זרימת cytometry, במיוחד בשילוב עם מכתים תאי לזהות ציטוקינים גורמי שעתוק, מספקת חוקרים עם טכניקה רבה עצמה המאפשרת זיהוי וכימות ברמת התא הבודדה של תת תאים חיסוניים איברים מוצקים. יש לנו אופטימיזציה ב assay מכתים תאיים לזהות על ידי זרימת cytometry תת תא T הגדולות נמצאות בכליות בעכברים, אבי העורקים ובלוטות לימפה ניקוז אבי העורקים במודל של יתר לחץ דם הנגרמת אנגיוטנסין II. אופטימיזציה של כל שלב: עיכול רקמות, לשעבר vivo הפעלה, permeabilization, ומשטח ותוצאות מכתימות תאיות בתוך ביותר מחדשassay הפקה כי ניתן ליישם מודלים למחלות לב וכלי דם כליות אחרים.
Protocol
Representative Results
Discussion
The protocol described herein has been optimized to properly identify T cell subsets present within murine kidneys, aorta and lymph nodes. This protocol can be easily adapted to examine other immune cell subsets such as B lymphocytes and innate immune cells and can be modified to include other tissue types. The digestion step is critical and has to be modified and optimized for each tissue9. A prolonged digestion step or the use of an inappropriate enzyme can affect the stability of antigen expression. Similar…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי פרס אחוות איגוד הלב האמריקני (16POST29950007) כדי FL, מענק מערך ההדרכה של המכון הלאומי לבריאות בארה"ב (NIH T32 HL069765) כדי BLD, פרס אחוות איגוד הלב האמריקני (14POST20420025) כדי MA סאלח, וכן NIH פרס K08 (HL121671) כדי MSM. MSM נתמכת גם על ידי מענק מחקר מן Gilead Sciences, Inc.
Materials
| Collagenase D | ROCHE | 11088882001 | |
| Collagenase A | ROCHE | 10103586001 | |
| Collagenase B | ROCHE | 11088815001 | |
| Dnase | ROCHE | 10104159001 | |
| 1X Red blood cell lysis buffer | eBioscience | 00-4333-57 | |
| RPMI Medium 1614 1X | Gibco | 11835-030 | |
| DPBS without calcium and magnesium | Gibco | 14190-144 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-5445-02 | For density gradient centrifugation |
| GentleMACS ™ C tube | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| GentleMACS dissociator device | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Use the program SPLEEN_04 |
| Cell activation cocktail (with Brefeldin A) | Biolegend | 423303 | |
| anti-CD16/32 | eBioscience | 14-0161-81 | dilute 1:100 |
| LIVE/DEAD fixable violet dead cell stain kit | Life Technologies | L34955 | |
| Transcription factor buffer set | BD Pharmingen | 562725 | |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111-42 | |
| 123 count eBeads | eBioscience | 01-1234-42 | |
| CD45 AmCyan (clone 30-F11) | BioLegend | 103138 | |
| CD3 PerCP-Cy5.5 (clone 17A2) | BioLegend | 100218 | |
| IL-17A FITC (clone TC11-18H10.1) | BioLegend | 506910 | |
| IL-17F APC (clone 9D3.1C8) | BioLegend | 517004 | |
| CD4 APC-Cy7 (clone GK1.5) | BD Biosciences | 560181 | |
| CD8 APC (clone 53-67) | eBioscience | 17-0081-82 | |
| T-bet PE-Cy7 (clone 4B10) | BioLegend | 644823 | |
| IFNγ FITC (clone XMG1.2) | BD Biosciences | 557724 |
References
- Saleh, M. A., McMaster, W. G., Wu, J., et al. Lymphocyte adaptor protein LNK deficiency exacerbates hypertension and end-organ inflammation. J Clin Invest. 125 (3), 1189-1202 (2015).
- Madhur, M. S., Lob, H. E., McCann, L. A., et al. Interleukin 17 promotes angiotensin II-induced hypertension and vascular dysfunction. Hypertension. 55 (2), 500-507 (2010).
- Laroumanie, F., Douin-Echinard, V., Pozzo, J., et al. CD4+ T Cells Promote the Transition From Hypertrophy to Heart Failure During Chronic Pressure Overload. Circulation. 129 (21), 2111-2124 (2014).
- Guzik, T. J., Hoch, N. E., Brown, K. A., et al. Role of the T cell in the genesis of angiotensin II induced hypertension and vascular dysfunction. J Exp Med. 204 (10), 2449-2460 (2007).
- Ketelhuth, D. F. J., Hansson, G. K. Adaptive Response of T and B Cells in Atherosclerosis. Circ Res. 118 (4), 668-678 (2016).
- McMaster, W. G., Kirabo, A., Madhur, M. S., Harrison, D. G. Inflammation, Immunity, and Hypertensive End-Organ Damage. Circ Res. (6), 1022-1033 (2015).
- Luckheeram, R. V., Zhou, R., Verma, A. D., et al. CD4+T Cells: Differentiation and Functions. Clin Dev Immunol. 2012, 1-12 (2012).
- Mittrücker, H. -. W., Visekruna, A., Huber, M. Heterogeneity in the differentiation and function of CD8+ T cells. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 62 (6), 449-458 (2014).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur J Microbiol Immunol (Bp). 2 (2), 112-120 (2012).
- Finak, G., Langweiler, M., Jaimes, M., et al. Standardizing Flow Cytometry Immunophenotyping Analysis from the Human ImmunoPhenotyping Consortium. Sci Rep. 6, 20686 (2016).
- Herzenberg, L. A., Parks, D., Sahaf, B., Perez, O., Roederer, M., Herzenberg, L. A. The history and future of the fluorescence activated cell sorter and flow cytometry: a view from Stanford. Clin Chem. 48 (10), 1819-1827 (2002).
- Hrvatin, S., Deng, F., O’Donnell, C. W., Gifford, D. K., Melton, D. A. MARIS: method for analyzing RNA following intracellular sorting. PLoS One. 9 (3), 89459 (2014).
- Kalisky, T., Quake, S. R. Single-cell genomics. Nat Methods. 8 (4), 311-314 (2011).
- Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Cytometry: Today’s technology and tomorrow’s horizons. Methods. 57 (3), 251-258 (2012).
- Jiang, L., Tixeira, R., Caruso, S., et al. Monitoring the progression of cell death and the disassembly of dying cells by flow cytometry. Nat Protoc. 11 (4), 655-663 (2016).
- Lemoine, S., Jaron, B., Tabka, S., et al. Dectin-1 activation unlocks IL12A expression and reveals the TH1 potency of neonatal dendritic cells. J Allergy Clin Immunol. 136 (5), 1355-1368 (2015).
- Gaublomme, J. T., Yosef, N., Lee, Y., et al. Single-Cell Genomics Unveils Critical Regulators of Th17 Cell Pathogenicity. Cell. 163 (6), 1400-1412 (2015).
