במבחנה בידול של האדם pluripotent בתאי גזע לתאי Trophoblastic
Summary
Here, we present a protocol to efficiently generate human trophoblastic cells from human pluripotent stem cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal pathways. This method is suitable for the efficient differentiation of human pluripotent stem cells and can generate large quantities of cells for genetic manipulation.
Abstract
השליה היא האיבר הראשון לפתח במהלך embryogenesis ודרושה להישרדות של העובר המתפתח. השליה מורכבת תאים trophoblastic שונים המבדילים מתאי trophectoderm חוץ עובריים של הבלסטוציסט preimplantation. ככזה, את הבנתנו את אירועי הבידול המוקדמים של השליה האנושית מוגבלת בגלל מגבלות אתיות ומשפטיות על בידוד המניפולציה של עובר אנושי. תאי גזע אנושיים pluripotent (hPSCs) הם מערכת מודל חזקה לחקירת התפתחות אנושית והוא יכול גם להיות מובחן במבחנה לתאים trophoblastic מבטאי סמנים של סוגי תאי trophoblast השונים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט להבחנת hPSCs לתאי trophoblastic באמצעות עצם morphogenic חלבון 4 ומעכבים של מסלולי איתות Activin / קטרים. פרוטוקול זה מייצר סוגי תאים trophoblast שונים שיכולים להיות transfected עם siRNAsעל חקירת פנוטיפים הפסד של פונקציה או יכול להיות נגוע פתוגנים. בנוסף, hPSCs ניתן מהונדס גנטי ולאחר מכן מובחן לתוך אבות trophoblast עבור רווח של פונקצית המנתח. שיטת בידול במבחנה זו להפקה trophoblasts אדם החל hPSCs מתגברת על המגבלות האתיות ומשפטיות של עבודה עם עוברי אדם מוקדם, מערכת זו יכולה לשמש עבור מגוון רחב של יישומים, כולל גילוי תרופות מחקר בתאי גזע.
Introduction
השליה נדרשת לצמיחה וההישרדות של העובר במהלך הריון ומקלה על חילופי גזים, חומרים מזינים, פסולת, והורמונים בין זרימת יולדות ועוברת. העוגב הראשון נוצרו במהלך העובר יונקים הוא השליה, שמתחיל לפתח 6-7 ימים לאחר ההתעברות בבני אדם ובבעלי 3.5-4.5 ימים בעכברים 1, 2, 3, 4. תאי Trophoblastic הם התאים החשובים ביותר של השליה, ותאים אלה מייצגים אחד אירועי בידול שושלת המוקדמים של העובר היונק. הם נובעים מתאי trophectoderm חוץ עובריים החיצוני של הבלסטוציסט preimplantation. הידע שלנו בשלבים המוקדמים של פיתוח שליה הוא מוגבל על ידי מגבלות אתיות ולוגיסטיות על דוגמנות התפתחות אנושית מוקדם.
במהלך השתלה העוברית, trophoblastsלפלוש האפיתל האימהי להתמיין ובתאים מתמחים 5. Cytotrophoblasts (CTBs) הם mononucleated, אבות מובחן כי הפתיל להתמיין syncytiotrophoblasts (SYNs) ו trophoblasts פולשנית extravillous (ד ^), אשר עוגן השליה אל הרחם. SYNs הוא multinucleated, תאים מובחנים סופנים כי לסנתז הורמונים הכרחיים לקיום הריון. האירועים בידול מוקדם שיוצרים ד ^ ו SYNs הם מרכיב חיוני לייצור השליה, כמו ליקויי בתאים trophoblastic לגרום להפלה, רעלת הריון, ו -1 פיגור גדילה תוך רחמי. סוגי שורות תאים אנושיים trophoblast אשר פותחו כוללים הנציחו CTBs ו choriocarcinomas, אשר מייצר הורמוני השליה ומאפייני פולשנית תצוגה 6. תאי trophoblastic ראשית ממנהל השליות הראשון בטרימסטר אדם יכולים להיות מבודדים, אבל התאים במהירות DIFferentiate ולהפסיק מתרבים במבחנה. חשוב לציין, הפך שורות תאים ראשוניות יש פרופילי ביטוי גנים שונים, המציין כי שורות תאי trophoblast tumorigenic והנציחו לא יכולות לייצג במדויק העיקרי trophoblasts 7. בנוסף, שורות אלה צפויות להידמות אבות תאי גזע trophoblast השליה כי הם נגזרים בשלב מאוחר תחילה דרך הטרימסטר שלישי.
יש צורך חזק במערכת תרבות חוץ גופייה של trophoblasts אדם בשלב מוקדם על מנת ללמוד את האירועים הראשונים של היווצרות שליה ותפקוד. תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs), אשר חולקים תכונות עם מסת התאים הפנימית של עובר preimplantation, משמשים לעתים קרובות מודל התפתחות אנושית מוקדם, כוללים ההיווצרות של השליה מוקדם. שני תאי גזע מושרים אנושיים (hiPSCs) ו hESCs ניתן להבדיל לתוך trophoblasts במבחנה באמצעות עצם מורחלבון 4 phogenic (BMP4) 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15. מרה זו של תאי פלוריפוטנטיים לתאי trophoblastic באמצעות BMP4 היא ספציפית עבור תאים אנושיים והיא בשימוש נרחב כדי ללמוד על ההתפתחות של השליה האנושית מוקדם כי היא אינה דורשת גישה עוברית אדם מוקדם 9, 16. לאחרונה, התגלה כי תוספת של מעכבי A83-01 (א) ו PD173074 (P), אשר חוסמים את המסלולים SMAD2 / 3 ו MEK1 / 2 איתות, מגביר את היעילות של בידול hPSC לתוך אבות דמוי trophectoderm, בעיקר SYNs ו ד ^, ללא דור נרחב של המזודרם, האנדודרם, או תאים האאקטודרם 9, 17 </sup>. באמצעות תנאים בינוניים אלה, hESCs בדיל עבור יש 12 ימים פרופילי ביטוי גנים דומה כתאי trophectoderm המבודדים עובר הבלסטוציסט הבמה אדם ומפרישים הורמוני גדילת השליה ספציפיות שונים, תומכי תוקפיו של מערכת מודל במבחנת 9, 11. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור בידול במבחנה של hPSCs לתוך אבות trophoblast אדם באמצעות BMP4 / A / P בינוני תרבות. תנאים אלה לייצר מספר שופע של תאים עבור מגוון רחב של יישומים, כולל רצף RNA, שיבוש הגן באמצעות siRNAs, זיהומים הפתוגן, ושינוי גנטי באמצעות transfection בתיווך lipofection.
Protocol
Representative Results
Discussion
הצגנו את הצעדים הבסיסיים המבדילים hESCs לתוך אבות trophoblast. פרוטוקול זה ממוטב לאחרונה להבדיל hESCs במהירות בתוספת Activin / קטרי איתות מעכבים, הגדלת הבידול לתאי trophoblastic והימנעות ההדורה של אבות mesoderm, אשר הם נצפו בדרך כלל עם טיפול BMP4 לבד. מערכת מודל BMP4 מאפשרת לבחינה בשלבים המוקדמי?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a Pennsylvania Health Research Formula Fund.
Materials
| DMEM/F12 | Invitrogen | 11330-057 | |
| Knock Out Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | This is referred to as "serum replacement" in this protocol. |
| NEAA | Invitrogen | 11140-050 | |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 10828-028 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-155 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M-7522 | |
| B-FGF | Millipore | GF-003 | |
| DMEM | Invitrogen | 11965-118 | |
| Dispase | Invitrogen | 17105-041 | |
| Collagenase Type IV | Invitrogen | 17104-019 | |
| Rock inhibitor Y27632 | Calbiochem | 688000 | |
| Irradiated CF1 MEFs | GlobalStem | 6001G | MEFs can be generated from embryonic day 13.5 embyos and irradiated. |
| 0.22 um syringe filter | Millipore | SLGS033SS | |
| Heracell 150i low oxygen incubator | Heracell/VWR | 89187-192 | Any tissue culture incubator with capacity to regulate oxygen concentrations is sufficient. |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP-01M | |
| A 83-01 | R&D Systems | 2939/10 | |
| PD173074 | R&D Systems | 3044/10 | |
| RNAiMax | Invitrogen | 13778150 | |
| Trizol | ThermoFisher | 15596026 | Trizol is used to isolate total RNA. |
| X-tremeGENE 9 | Roche | 6365779001 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | This is referred to as "extracellular matrix" in this protocol. |
References
- Rugg-Gunn, P. J. Epigenetic features of the mouse trophoblast. Reproductive biomedicine online. 25 (1), 21-30 (2012).
- Rossant, J., Cross, J. C. Placental development: lessons from mouse mutants. Nature reviews. Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).
- Hertig, A. T., Rock, J., Adams, E. C., Menkin, M. C. Thirty-four fertilized human ova, good, bad and indifferent, recovered from 210 women of known fertility; a study of biologic wastage in early human pregnancy. Pediatrics. 23 (1 Part 2), 202-211 (1959).
- Steptoe, P. C., Edwards, R. G., Purdy, J. M. Human blastocysts grown in culture. Nature. 229 (5280), 132-133 (1971).
- Delorme-Axford, E., Sadovsky, Y., Coyne, C. B. The placenta as a barrier to viral infections. Annual Review of Virology. 1, 133-146 (2014).
- Ji, L., et al. Placental trophoblast cell differentiation: physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia. Molecular aspects of medicine. 34 (5), 981-1023 (2013).
- Bilban, M., et al. Identification of novel trophoblast invasion-related genes: heme oxygenase-1 controls motility via peroxisome proliferator-activated receptor gamma. Endocrinology. 150 (2), 1000-1013 (2009).
- Xu, R. H., et al. BMP4 initiates human embryonic stem cell differentiation to trophoblast. Nature biotechnology. 20 (12), 1261-1264 (2002).
- Amita, M., et al. Complete and unidirectional conversion of human embryonic stem cells to trophoblast by BMP4. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), E1212-E1221 (2013).
- Genbacev, O., et al. Establishment of human trophoblast progenitor cell lines from the chorion. Stem Cells. 29 (9), 1427-1436 (2011).
- Marchand, M., et al. Transcriptomic signature of trophoblast differentiation in a human embryonic stem cell model. Biology of reproduction. 84 (6), 1258-1271 (2011).
- Hyslop, L., et al. Downregulation of NANOG induces differentiation of human embryonic stem cells to extraembryonic lineages. Stem cells. 23 (8), 1035-1043 (2005).
- Harun, R., et al. Cytotrophoblast stem cell lines derived from human embryonic stem cells and their capacity to mimic invasive implantation events. Human reproduction. 21 (6), 1349-1358 (2006).
- Lichtner, B., Knaus, P., Lehrach, H., Adjaye, J. BMP10 as a potent inducer of trophoblast differentiation in human embryonic and induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 34 (38), 9789-9802 (2013).
- Chen, Y., Wang, K., Chandramouli, G. V., Knott, J. G., Leach, R. Trophoblast lineage cells derived from human induced pluripotent stem cells. Biochemical and biophysical research communications. , (2013).
- Roberts, R. M., et al. Differentiation of trophoblast cells from human embryonic stem cells: to be or not to be?. Reproduction. 147 (5), D1-D12 (2014).
- Sarkar, P., et al. Activin/nodal signaling switches the terminal fate of human embryonic stem cell-derived trophoblasts. The Journal of biological chemistry. 290 (14), 8834-8848 (2015).
- Penkala, I., et al. lncRHOXF1, a Long Noncoding RNA from the X Chromosome That Suppresses Viral Response Genes during Development of the Early Human Placenta. Mol Cell Biol. 36 (12), 1764-1775 (2016).
- Penkala, I., et al. lncRHOXF1, a Long Noncoding RNA from the X Chromosome That Suppresses Viral Response Genes during Development of the Early Human Placenta. Molecular and cellular biology. 36 (12), 1764-1775 (2016).
- Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nature biotechnology. 29 (8), 731-734 (2011).
- Bernardo, A. S., et al. BRACHYURY and CDX2 mediate BMP-induced differentiation of human and mouse pluripotent stem cells into embryonic and extraembryonic lineages. Cell stem cell. 9 (2), 144-155 (2011).
- Zhang, P., et al. Short-term BMP-4 treatment initiates mesoderm induction in human embryonic stem cells. Blood. 111 (4), 1933-1941 (2008).
- Vallier, L., et al. Early cell fate decisions of human embryonic stem cells and mouse epiblast stem cells are controlled by the same signalling pathways. PloS one. 4 (6), e6082 (2009).
- Arman, E., Haffner-Krausz, R., Chen, Y., Heath, J. K., Lonai, P. Targeted disruption of fibroblast growth factor (FGF) receptor 2 suggests a role for FGF signaling in pregastrulation mammalian development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (9), 5082-5087 (1998).
- Yu, P., Pan, G., Yu, J., Thomson, J. A. FGF2 sustains NANOG and switches the outcome of BMP4-induced human embryonic stem cell differentiation. Cell stem cell. 8 (3), 326-334 (2011).
- Sudheer, S., Bhushan, R., Fauler, B., Lehrach, H., Adjaye, J. FGF inhibition directs BMP4-mediated differentiation of human embryonic stem cells to syncytiotrophoblast. Stem cells and development. 21 (16), 2987-3000 (2012).
- Bischof, P., Irminger-Finger, I. The human cytotrophoblastic cell, a mononuclear chameleon. The international journal of biochemistry & cell biology. 37 (1), 1-16 (2005).
- Cole, L. A. Hyperglycosylated hCG, a review. Placenta. 31 (8), 653-664 (2010).
- Apps, R., et al. Human leucocyte antigen (HLA) expression of primary trophoblast cells and placental cell lines, determined using single antigen beads to characterize allotype specificities of anti-HLA antibodies. Immunology. 127 (1), 26-39 (2009).
