In Vitro Différenciation des cellules souches pluripotentes humaines en cellules trophoblastiques
Summary
Here, we present a protocol to efficiently generate human trophoblastic cells from human pluripotent stem cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal pathways. This method is suitable for the efficient differentiation of human pluripotent stem cells and can generate large quantities of cells for genetic manipulation.
Abstract
Le placenta est le premier organe à développer au cours de l'embryogenèse et est nécessaire pour la survie de l'embryon en développement. Le placenta est composé de différentes cellules trophoblastiques qui se différencient à partir des cellules du trophectoderme extra-embryonnaire du blastocyste préimplantatoire. En tant que tel, notre compréhension des événements de différenciation précoce du placenta humain est limitée en raison des restrictions éthiques et juridiques sur l'isolement et la manipulation de l'embryogenèse humaine. Les cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) sont un système modèle robuste pour enquêter sur le développement humain et peuvent également être différenciées in vitro en cellules trophoblastiques qui expriment des marqueurs des différents types de cellules trophoblastiques. Ici, nous présentons un protocole détaillé pour différencier hPSCs dans les cellules trophoblastiques en utilisant la protéine morphogénétique osseuse 4 et inhibiteurs des activine / voies de signalisation Nodal. Ce protocole génère divers types de cellules trophoblastiques qui peuvent être transfectées avec des ARNsipour enquêter sur les phénotypes de perte de fonction ou peuvent être infectés par des agents pathogènes. En outre, hPSCs peuvent être génétiquement modifiés puis différenciées en progéniteurs trophoblaste pour les analyses de gain de fonction. Cette méthode in vitro de différenciation pour générer trophoblastes humains à partir de hPSCs surmonte les restrictions éthiques et juridiques de travailler avec des embryons humains précoces, et ce système peut être utilisé pour une variété d'applications, y compris la découverte de médicaments et les cellules souches.
Introduction
Le placenta est nécessaire pour la croissance et la survie du fœtus pendant la grossesse et facilite l'échange de gaz, des nutriments, des déchets et des hormones entre la circulation maternelle et fœtale. Le premier organe formé au cours de l' embryogenèse chez les mammifères est le placenta, qui commence à développer 6-7 jours après la conception chez l' homme et chez la souris 3,5-4,5 jours 1, 2, 3, 4. les cellules sont des cellules trophoblastiques les plus importantes du placenta, et ces cellules représentent l'un des événements les plus précoces de la différenciation de la lignée de l'embryon de mammifère. Elles proviennent des cellules du trophectoderme extra-embryonnaires externes du blastocyste préimplantatoire. Notre connaissance des premiers stades du développement placentaire est limitée par les restrictions éthiques et logistiques sur la modélisation du développement humain précoce.
Au cours de l'implantation embryonnaire, trophoblastesenvahir l'épithélium maternelle et se différencier en cellules progénitrices spécialisés 5. Cytotrophoblastes (CTBS) sont mononucléées, progéniteurs indifférenciés qui fusionnent et se différencient en syncytiotrophoblastes (SYN) et trophoblastes invasives extravilleux (de EVTS), qui ancre le placenta à l'utérus. SYNs sont multinucléées, les cellules différenciées qui synthétisent les hormones nécessaires au maintien de la grossesse. Les événements de différenciation précoce qui génèrent EVTS et SYNs sont essentiels pour la formation du placenta, comme les déficiences dans les cellules trophoblastiques aboutissent à une fausse couche, la pré-éclampsie, et la restriction de croissance intra – utérine 1. Les types de lignées cellulaires trophoblastiques humaines qui ont été développées comprennent immortalisés CTBS et choriocarcinome, qui produisent des hormones placentaires et présentent des propriétés invasives 6. cellules trophoblastiques primaires de placentas premier trimestre humains peuvent être isolés, mais les cellules rapidement differentiate et arrêter la prolifération in vitro. Surtout, transformé et des lignées de cellules primaires ont des profils d'expression de gènes différents, ce qui indique que les lignées cellulaires tumorigènes et immortalisés trophoblaste peuvent ne pas représenter exactement les trophoblastes principaux 7. En outre, ces lignes ne sont pas susceptibles de ressembler à trophoblaste placentaire progéniteurs des cellules souches parce qu'ils sont dérivés de stade plus avancé d'abord par le troisième trimestre.
Il y a un besoin pour un robuste système de culture in vitro de stade précoce trophoblastes humains afin d'étudier les événements précoces de la formation et de la fonction placentaire. cellules souches embryonnaires humaines (CSEh), qui partagent les propriétés avec la masse cellulaire interne de l'embryon préimplantatoire, sont fréquemment utilisés pour modéliser le développement humain précoce, y compris la formation du début du placenta. Les deux cellules d'origine humaine souches pluripotentes (de hiPSCs) et CSEh peuvent être différenciées en trophoblaste in vitro utilisant des os MorLa protéine phogenic 4 (BMP4) , 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15. Cette conversion des cellules pluripotentes à des cellules trophoblastiques utilisant BMP4 est spécifique pour les cellules humaines et est largement utilisé pour étudier le développement du placenta humain tôt , car il ne nécessite pas l' accès à des embryons humains précoces 9, 16. Récemment, on a découvert que l'addition des inhibiteurs A83-01 (A) et PD173074 (P), qui bloquent les voies SMAD2 / 3 et MEK1 / 2 signalisation, augmente l'efficacité de la différenciation des progéniteurs dans HPSC trophectoderme analogue, principalement SYNs et EVTS, sans la génération étendue de mésoderme, endoderme, ectoderme ou des cellules 9, 17 </sup>. En utilisant ces conditions moyennes, hESC différenciées pendant 12 jours ont des profils d'expression génique similaire à des cellules du trophectoderme isolées à partir d' embryons blastocyste stade humain et sécrètent diverses hormones de croissance placentaire spécifique, en soutenant la validité de ce système in vitro du modèle 9, 11. Ici, nous présentons un protocole détaillé pour la différenciation des hPSCs in vitro dans les progéniteurs trophoblastiques humaines en utilisant BMP4 / A / P milieu de culture. Ces conditions produisent des nombres de cellules abondantes pour une grande variété d'applications, y compris le séquençage de l'ARN, de disruption de gène en utilisant des ARNsi, des infections pathogènes, et la modification génétique en utilisant la transfection à médiation par lipofection.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous avons présenté les étapes de base pour différencier les CSEh en progéniteurs trophoblaste. Ce protocole a récemment été optimisé pour différencier rapidement hESC avec l'addition d'inhibiteurs de l'activine / signalisation Nodal, en augmentant la différenciation des cellules trophoblastiques et en évitant la production de progéniteurs de mésoderme, qui sont généralement observés avec le traitement de la BMP4 seul. Le système de modèle de BMP4 permet l'examen des premiers stades de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a Pennsylvania Health Research Formula Fund.
Materials
| DMEM/F12 | Invitrogen | 11330-057 | |
| Knock Out Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | This is referred to as "serum replacement" in this protocol. |
| NEAA | Invitrogen | 11140-050 | |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 10828-028 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-155 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M-7522 | |
| B-FGF | Millipore | GF-003 | |
| DMEM | Invitrogen | 11965-118 | |
| Dispase | Invitrogen | 17105-041 | |
| Collagenase Type IV | Invitrogen | 17104-019 | |
| Rock inhibitor Y27632 | Calbiochem | 688000 | |
| Irradiated CF1 MEFs | GlobalStem | 6001G | MEFs can be generated from embryonic day 13.5 embyos and irradiated. |
| 0.22 um syringe filter | Millipore | SLGS033SS | |
| Heracell 150i low oxygen incubator | Heracell/VWR | 89187-192 | Any tissue culture incubator with capacity to regulate oxygen concentrations is sufficient. |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP-01M | |
| A 83-01 | R&D Systems | 2939/10 | |
| PD173074 | R&D Systems | 3044/10 | |
| RNAiMax | Invitrogen | 13778150 | |
| Trizol | ThermoFisher | 15596026 | Trizol is used to isolate total RNA. |
| X-tremeGENE 9 | Roche | 6365779001 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | This is referred to as "extracellular matrix" in this protocol. |
References
- Rugg-Gunn, P. J. Epigenetic features of the mouse trophoblast. Reproductive biomedicine online. 25 (1), 21-30 (2012).
- Rossant, J., Cross, J. C. Placental development: lessons from mouse mutants. Nature reviews. Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).
- Hertig, A. T., Rock, J., Adams, E. C., Menkin, M. C. Thirty-four fertilized human ova, good, bad and indifferent, recovered from 210 women of known fertility; a study of biologic wastage in early human pregnancy. Pediatrics. 23 (1 Part 2), 202-211 (1959).
- Steptoe, P. C., Edwards, R. G., Purdy, J. M. Human blastocysts grown in culture. Nature. 229 (5280), 132-133 (1971).
- Delorme-Axford, E., Sadovsky, Y., Coyne, C. B. The placenta as a barrier to viral infections. Annual Review of Virology. 1, 133-146 (2014).
- Ji, L., et al. Placental trophoblast cell differentiation: physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia. Molecular aspects of medicine. 34 (5), 981-1023 (2013).
- Bilban, M., et al. Identification of novel trophoblast invasion-related genes: heme oxygenase-1 controls motility via peroxisome proliferator-activated receptor gamma. Endocrinology. 150 (2), 1000-1013 (2009).
- Xu, R. H., et al. BMP4 initiates human embryonic stem cell differentiation to trophoblast. Nature biotechnology. 20 (12), 1261-1264 (2002).
- Amita, M., et al. Complete and unidirectional conversion of human embryonic stem cells to trophoblast by BMP4. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), E1212-E1221 (2013).
- Genbacev, O., et al. Establishment of human trophoblast progenitor cell lines from the chorion. Stem Cells. 29 (9), 1427-1436 (2011).
- Marchand, M., et al. Transcriptomic signature of trophoblast differentiation in a human embryonic stem cell model. Biology of reproduction. 84 (6), 1258-1271 (2011).
- Hyslop, L., et al. Downregulation of NANOG induces differentiation of human embryonic stem cells to extraembryonic lineages. Stem cells. 23 (8), 1035-1043 (2005).
- Harun, R., et al. Cytotrophoblast stem cell lines derived from human embryonic stem cells and their capacity to mimic invasive implantation events. Human reproduction. 21 (6), 1349-1358 (2006).
- Lichtner, B., Knaus, P., Lehrach, H., Adjaye, J. BMP10 as a potent inducer of trophoblast differentiation in human embryonic and induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 34 (38), 9789-9802 (2013).
- Chen, Y., Wang, K., Chandramouli, G. V., Knott, J. G., Leach, R. Trophoblast lineage cells derived from human induced pluripotent stem cells. Biochemical and biophysical research communications. , (2013).
- Roberts, R. M., et al. Differentiation of trophoblast cells from human embryonic stem cells: to be or not to be?. Reproduction. 147 (5), D1-D12 (2014).
- Sarkar, P., et al. Activin/nodal signaling switches the terminal fate of human embryonic stem cell-derived trophoblasts. The Journal of biological chemistry. 290 (14), 8834-8848 (2015).
- Penkala, I., et al. lncRHOXF1, a Long Noncoding RNA from the X Chromosome That Suppresses Viral Response Genes during Development of the Early Human Placenta. Mol Cell Biol. 36 (12), 1764-1775 (2016).
- Penkala, I., et al. lncRHOXF1, a Long Noncoding RNA from the X Chromosome That Suppresses Viral Response Genes during Development of the Early Human Placenta. Molecular and cellular biology. 36 (12), 1764-1775 (2016).
- Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nature biotechnology. 29 (8), 731-734 (2011).
- Bernardo, A. S., et al. BRACHYURY and CDX2 mediate BMP-induced differentiation of human and mouse pluripotent stem cells into embryonic and extraembryonic lineages. Cell stem cell. 9 (2), 144-155 (2011).
- Zhang, P., et al. Short-term BMP-4 treatment initiates mesoderm induction in human embryonic stem cells. Blood. 111 (4), 1933-1941 (2008).
- Vallier, L., et al. Early cell fate decisions of human embryonic stem cells and mouse epiblast stem cells are controlled by the same signalling pathways. PloS one. 4 (6), e6082 (2009).
- Arman, E., Haffner-Krausz, R., Chen, Y., Heath, J. K., Lonai, P. Targeted disruption of fibroblast growth factor (FGF) receptor 2 suggests a role for FGF signaling in pregastrulation mammalian development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (9), 5082-5087 (1998).
- Yu, P., Pan, G., Yu, J., Thomson, J. A. FGF2 sustains NANOG and switches the outcome of BMP4-induced human embryonic stem cell differentiation. Cell stem cell. 8 (3), 326-334 (2011).
- Sudheer, S., Bhushan, R., Fauler, B., Lehrach, H., Adjaye, J. FGF inhibition directs BMP4-mediated differentiation of human embryonic stem cells to syncytiotrophoblast. Stem cells and development. 21 (16), 2987-3000 (2012).
- Bischof, P., Irminger-Finger, I. The human cytotrophoblastic cell, a mononuclear chameleon. The international journal of biochemistry & cell biology. 37 (1), 1-16 (2005).
- Cole, L. A. Hyperglycosylated hCG, a review. Placenta. 31 (8), 653-664 (2010).
- Apps, R., et al. Human leucocyte antigen (HLA) expression of primary trophoblast cells and placental cell lines, determined using single antigen beads to characterize allotype specificities of anti-HLA antibodies. Immunology. 127 (1), 26-39 (2009).
