In Vitro Différenciation des cellules souches pluripotentes humaines en cellules trophoblastiques

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour générer efficacement des cellules trophoblastiques humaines à partir de cellules souches pluripotentes humaines en utilisant la protéine morphogénique osseuse 4 et des inhibiteurs des voies Activin/Nodal. Cette méthode est adaptée à la différenciation efficace des cellules souches pluripotentes humaines et peut générer de grandes quantités de cellules pour la manipulation génétique.

Résumé

Le placenta est le premier organe à développer au cours de l'embryogenèse et est nécessaire pour la survie de l'embryon en développement. Le placenta est composé de différentes cellules trophoblastiques qui se différencient à partir des cellules du trophectoderme extra-embryonnaire du blastocyste préimplantatoire. En tant que tel, notre compréhension des événements de différenciation précoce du placenta humain est limitée en raison des restrictions éthiques et juridiques sur l'isolement et la manipulation de l'embryogenèse humaine. Les cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) sont un système modèle robuste pour enquêter sur le développement humain et peuvent également être différenciées in vitro en cellules trophoblastiques qui expriment des marqueurs des différents types de cellules trophoblastiques. Ici, nous présentons un protocole détaillé pour différencier hPSCs dans les cellules trophoblastiques en utilisant la protéine morphogénétique osseuse 4 et inhibiteurs des activine / voies de signalisation Nodal. Ce protocole génère divers types de cellules trophoblastiques qui peuvent être transfectées avec des ARNsipour enquêter sur les phénotypes de perte de fonction ou peuvent être infectés par des agents pathogènes. En outre, hPSCs peuvent être génétiquement modifiés puis différenciées en progéniteurs trophoblaste pour les analyses de gain de fonction. Cette méthode in vitro de différenciation pour générer trophoblastes humains à partir de hPSCs surmonte les restrictions éthiques et juridiques de travailler avec des embryons humains précoces, et ce système peut être utilisé pour une variété d'applications, y compris la découverte de médicaments et les cellules souches.

Introduction

Le placenta est nécessaire pour la croissance et la survie du fœtus pendant la grossesse et facilite l'échange de gaz, des nutriments, des déchets et des hormones entre la circulation maternelle et fœtale. Le premier organe formé au cours de l' embryogenèse chez les mammifères est le placenta, qui commence à développer 6-7 jours après la conception chez l' homme et chez la souris 3,5-4,5 jours ^{1, 2, 3, 4.} les cellules sont des cellules trophoblastiques les plus importantes du placenta, et ces cellules représentent l'un des é....

Protocole

NOTE: Pour la différenciation des CSEh soit ou hiPSCs en progéniteurs trophoblaste, hPSCs cultivées sur des fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) sont transition vers feeder libres conditions pour deux passages avant d'initier la différenciation avec BMP4 / A / P. Ce processus élimine la contamination MEF de cellules différenciées. Ici, nous présentons un protocole pour la différenciation des CSEh, et le même protocole peut être appliqué à hiPSCs.

1. Culture et récupération des CSEh sur irradiées fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) (Préparation)

1. Gamma-irradiation de MEFs
   1. Faire 500 ml de milieu pour la cultu....

Résultats

Vue d'ensemble de différenciation in vitro de hPSCs

Ce protocole de différenciation in vitro de cellules hES non différenciées commence cultivées sur MEFs qui sont passés à feeder libres conditions pour un passage (figure 1A). Alors que nous avons décrit la différenciation des CSEh dans ce protocole, nous avons utilisé ce protocole pour différencier avec succès hiPSCs dans les cellules troph.......

Discussion

Nous avons présenté les étapes de base pour différencier les CSEh en progéniteurs trophoblaste. Ce protocole a récemment été optimisé pour différencier rapidement hESC avec l'addition d'inhibiteurs de l'activine / signalisation Nodal, en augmentant la différenciation des cellules trophoblastiques et en évitant la production de progéniteurs de mésoderme, qui sont généralement observés avec le traitement de la BMP4 seul. Le système de modèle de BMP4 permet l'examen des premiers stades de la spécification t.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
DMEM/F12	Invitrogen	11330-057
Knock Out Remplacement du sérum	Invitrogen	10828-028	C’est ce qu’on appelle le « remplacement du sérum » dans ce protocole.
NEAA	Invitrogen	11140-050
FBS	Invitrogen	16000-044
L-Glutamine	Invitrogen	10828-028
Pénicilline/Streptomycine	Invitrogen	15140-155
2-Mercaptoethanol	Sigma	M-7522
B-FGF	Millipore	GF-003
DMEM	Invitrogen	11965-118
Dispase	Invitrogen	17105-041
Collagénase de type IV	Invitrogen	17104-019
Inhibiteur de roche Y27632	Calbiochem	688000
CF1 MEFs irradiés	GlobalStem	6001G	Les MEF peuvent être générés à partir du jour embryonnaire 13,5 embyos et irradiés.
0,22 et micro ; Filtre à seringue	Millipore	SLGS033SS
Heracell 150i Incubateur à faible teneur en oxygène	Heracell/VWR	89187-192	Tout incubateur de culture tissulaire capable de réguler les concentrations d’oxygène est suffisant.
BMP4	R& D Systems	314-BP-01M
A 83-01	R& D Systems	2939/10
PD173074	R& D Systems	3044/10
RNAiMax	Invitrogen	13778150
Trizol	ThermoFisher	15596026	Trizol est utilisé pour isoler l’ARN total.
X-tremeGENE 9	Roche	6365779001
Matrigel	Corning	356231	C’est ce que l’on appelle la « matrice extracellulaire » dans ce protocole.