ヒト多能性幹細胞のin vitro分化における絨毛細胞へ
Summary
Here, we present a protocol to efficiently generate human trophoblastic cells from human pluripotent stem cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal pathways. This method is suitable for the efficient differentiation of human pluripotent stem cells and can generate large quantities of cells for genetic manipulation.
Abstract
胎盤は、胚発生の間に開発した最初の臓器であり、発達中の胚の生存のために必要とされます。胎盤は、着床前胚盤胞の胚体外栄養外胚葉細胞から分化する様々な栄養膜細胞から構成されています。このように、ヒト胎盤の早期分化事象の理解があるため、人間の胚発生の単離および操作上の倫理的および法的制約のために制限されています。ヒト多能性幹細胞（hPSCs）人間開発を研究するための強力なモデル系であり、また、種々の栄養膜細胞型のマーカーを発現する栄養膜細胞にインビトロで分化させることができます。ここでは、骨形成タンパク質4及びアクチビン/ノダルシグナル伝達経路の阻害剤を使用して、栄養膜細胞にhPSCsを区別するための詳細なプロトコルを提示します。このプロトコルは、siRNAでトランスフェクトすることができる種々の栄養膜細胞型を生成します機能喪失表現型を調査するため、または病原体に感染させることができます。さらに、hPSCsは、遺伝的に変更することができ、その後の機能獲得分析のための栄養膜の前駆細胞に分化しました。 hPSCsから始まる人間栄養芽細胞を生成するためのこのインビトロ分化方法は、ヒト初期胚での作業の倫理的、法的な制限を克服し、このシステムは、創薬・幹細胞研究を含め、様々な用途に使用することができます。
Introduction
胎盤は、妊娠中の胎児の成長と生存のために必要と母体と胎児循環の間の気体、栄養素、老廃物、およびホルモンの交換を容易にされています。哺乳類の胚発生の間に形成された第一の臓器は、ヒトおよびマウスの1で3.5から4.5日で6-7日後受胎の開発から始まり、胎盤、2、3、4です。栄養膜細胞が胎盤の最も重要な細胞であり、これらの細胞は、哺乳動物の胚の初期の系統分化のイベントのいずれかを表します。彼らは、着床前胚盤胞の外胚体外栄養外胚葉細胞から生じます。胎盤の開発の初期段階の私たちの知識は、早期人間開発のモデリング上の倫理や物流の制限によって制限されています。
胚移植時には、トロホブラスト母性上皮に侵入し、専門の前駆細胞5に分化します。細胞栄養芽層（のCTB）が融合し、子宮にアンカー胎盤合胞体（のSYN）とextravillous侵襲性栄養膜（EVTs）に分化単核、未分化前駆細胞です。 SYNは、妊娠を維持するために必要なホルモンを合成する多核、最終分化細胞です。絨毛細胞での障害は流産、子癇前症、および子宮内発育制限1になるようEVTsとのSYNを生成する初期分化事象は、胎盤形成に必須です。開発されてきた人間の栄養膜細胞株の種類は胎盤ホルモンを産生のCTBと絨毛を、不死化および浸潤特性6を表示することを含みます。人間の妊娠第一期の胎盤を単離することができるが、細胞はすぐにDIFから初代栄養膜細胞ferentiateおよびin vitroで増殖して停止します。重要なことには、形質転換された、一次細胞株は、腫瘍形成および不死化栄養膜細胞株は、正確に一次栄養膜7を表していない可能性があることを示し、異なる遺伝子発現プロファイルを有します。さらに、これらの行は、それらが三学期を介して第1の後段に由来しているため、胎盤トロホブラスト幹細胞前駆体に似ている可能性は低いです。
胎盤の形成と機能の初期事象を研究するために、初期段階のヒト栄養芽細胞の体外培養系における堅牢なの必要性があります。着床前胚の内部細胞塊と特性を共有するヒト胚性幹細胞（hESC）は、しばしば早期胎盤の形成を含む、初期のヒトの発生をモデル化するために使用されます。ヒト人工多能性幹細胞（hiPSCs）およびヒトES細胞の両方は、骨モルを用いてインビトロで栄養芽細胞に分化させることができますphogenicタンパク質4（BMP4）8、9、10、11、12、13、14、15。 BMP4を使用して栄養膜細胞への多能性細胞のこの変換は、人間の細胞に特異的であり、それは初期ヒト胚9、16へのアクセスを必要としないため、広く初期のヒト胎盤の発達を研究するために使用されます。最近、SMAD2 / 3及びMEK1 / 2シグナル伝達経路を遮断する阻害剤A83-01（A）およびPD173074（P）の添加は、栄養外胚葉様前駆細胞、主にSYNのにHPSCの分化の効率を高めることが発見されました中胚葉、内胚葉、または外胚葉細胞9の大規模な発生がなく、EVTs、17 </suP>。これらの培地条件を用いて、12日間分化ヒトES細胞は、ヒト胚盤胞段階の胚から単離された栄養外胚葉細胞と同様の遺伝子発現プロファイルを有しており、種々の胎盤特異的成長ホルモンを分泌し、in vitroモデル系9、11本の妥当性を支持します。ここでは、BMP4 / A / P培地を用いて、ヒト栄養芽前駆細胞へのhPSCsのインビトロ分化のための詳細なプロトコルを提示します。これらの条件は、リポフェクション媒介性トランスフェクションを用いたRNA配列、siRNAを用いた遺伝子破壊、病原体感染、遺伝的改変を含む、多種多様な用途のための細胞の過剰数を生成します。
Protocol
Representative Results
Discussion
私たちは、栄養膜の前駆細胞にヒトES細胞を区別するための基本的な手順を提示しました。このプロトコルは、最近栄養膜細胞への分化を増加させ、典型的には単独のBMP4処理で観察された中胚葉前駆細胞の発生を回避すること、急速にアクチビン/ノーダルシグナル伝達阻害剤を添加してヒトES細胞を区別するために最適化されています。 BMP4のモデルシステムは、人間の栄養膜細胞系譜の仕?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a Pennsylvania Health Research Formula Fund.
Materials
| DMEM/F12 | Invitrogen | 11330-057 | |
| Knock Out Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | This is referred to as "serum replacement" in this protocol. |
| NEAA | Invitrogen | 11140-050 | |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 10828-028 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-155 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M-7522 | |
| B-FGF | Millipore | GF-003 | |
| DMEM | Invitrogen | 11965-118 | |
| Dispase | Invitrogen | 17105-041 | |
| Collagenase Type IV | Invitrogen | 17104-019 | |
| Rock inhibitor Y27632 | Calbiochem | 688000 | |
| Irradiated CF1 MEFs | GlobalStem | 6001G | MEFs can be generated from embryonic day 13.5 embyos and irradiated. |
| 0.22 um syringe filter | Millipore | SLGS033SS | |
| Heracell 150i low oxygen incubator | Heracell/VWR | 89187-192 | Any tissue culture incubator with capacity to regulate oxygen concentrations is sufficient. |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP-01M | |
| A 83-01 | R&D Systems | 2939/10 | |
| PD173074 | R&D Systems | 3044/10 | |
| RNAiMax | Invitrogen | 13778150 | |
| Trizol | ThermoFisher | 15596026 | Trizol is used to isolate total RNA. |
| X-tremeGENE 9 | Roche | 6365779001 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | This is referred to as "extracellular matrix" in this protocol. |
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