म्यूरीन लिम्फोसाइट लेबलिंग द्वारा<sup> 64</sup> Cu-एंटीबॉडी रिसेप्टर के लिए लक्ष्य निर्धारण<em> में विवो</em> पीईटी / सी टी द्वारा सेल तस्करी
Summary
एक 64 Cu संशोधित मोनोक्लोनल एंटीबॉडी एक ट्रांसजेनिक murine टी सेल रिसेप्टर के लिए बाध्य की तैयारी के बाद, टी कोशिकाओं विवो में radiolabeled हैं, व्यवहार्यता, कार्यक्षमता, लेबलिंग स्थिरता और apoptosis के लिए विश्लेषण किया, और adoptively एक airway देरी प्रकार अतिसंवेदनशीलता के साथ चूहों में स्थानांतरित गैर इनवेसिव पोजीट्रान एमिशन टोमोग्राफी / अभिकलन टोमोग्राफी (पीईटी / सीटी) द्वारा इमेजिंग के लिए प्रतिक्रिया।
Abstract
यह प्रोटोकॉल 64 Cu के उत्पादन और chelator विकार / एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (mAb) की radiolabeling murine लिम्फोसाइट सेल संस्कृति और 64 Cu-एंटीबॉडी रिसेप्टर कोशिकाओं को लक्ष्य करने के बाद दिखाता है। की radiolabel और इन विवो सेल ट्रैकिंग में गैर इनवेसिव एक airway देरी प्रकार अतिसंवेदनशीलता रिएक्शन (DTHR) पीईटी / सी टी द्वारा का एक पशु मॉडल में वर्णित इन विट्रो मूल्यांकन में।
विस्तार में, chelator 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic एसिड (DOTA) के साथ एक mAb के संयोजन दिखाया गया है। रेडियोधर्मी 64 Cu, DOTA-संयुग्मित mAb की radiolabeling के उत्पादन के बाद में वर्णित है। इसके बाद, चिकन ovalbumin (कोवा) विशिष्ट सीडी 4 + इंटरफेरॉन का विस्तार (IFN) -γ उत्पादक टी सहायक कोशिकाओं (कोवा-TH1) और कोवा-TH1 कोशिकाओं के बाद radiolabeling चित्रित कर रहे हैं। विभिन्न विट्रो तकनीक में एफई मूल्यांकन करने के लिए प्रस्तुत कर रहे हैंइस तरह के trypan नीले अपवर्जन द्वारा सेल व्यवहार्यता का निर्धारण, प्रवाह cytometry के लिए Annexin वी के साथ apoptosis के लिए धुंधला, और IFN-γ एंजाइम से जुड़ी immunosorbent परख द्वारा कार्यक्षमता के मूल्यांकन के रूप में कोशिकाओं पर 64 Cu-radiolabeling की fects, (एलिसा) । इसके अलावा, कोशिकाओं में रेडियोधर्मी तेज और लेबलिंग स्थिरता के निर्धारण के बारे में विस्तार से बताया गया है। यह प्रोटोकॉल आगे कैसे एक airway DTHR के लिए एक पशु मॉडल में सेल ट्रैकिंग अध्ययन प्रदर्शन करने के लिए है और इसलिए, BALB / ग चूहों में कोवा प्रेरित तीव्र वायु-मार्ग DHTR के शामिल होने शामिल किया गया है वर्णन करता है। अंत में, छवि अधिग्रहण, पुनर्निर्माण, और विश्लेषण सहित एक मजबूत पीईटी / सी टी कार्यप्रवाह प्रस्तुत किया है।
64 Cu-एंटीबॉडी रिसेप्टर बाद रिसेप्टर internalization के साथ लक्षित कर दृष्टिकोण, सेल लेबलिंग के लिए आम पीईटी ट्रेसर की तुलना में उच्च विशिष्टता और स्थिरता, कम सेलुलर विषाक्तता, और कम तपका दर प्रदान करता है जैसे 64 Cu-pyruvaldehyde बिस (एन 4-methylthiosemicarbazone) (64 Cu-PTSM)। अंत में, हमारे दृष्टिकोण 48 घंटे के लिए एक इष्टतम संकेत करने वाली पृष्ठभूमि अनुपात के साथ पीईटी / सी टी द्वारा विवो सेल ट्रैकिंग में गैर इनवेसिव सक्षम बनाता है। इस प्रयोगात्मक दृष्टिकोण झिल्ली से बंधा रिसेप्टर्स कि भाँति रहे हैं के साथ विभिन्न पशु मॉडल और प्रकार की कोशिकाओं को हस्तांतरित किया जा सकता है।
Introduction
गैर इनवेसिव सेल ट्रैकिंग सेल समारोह, विवो में प्रवास और होमिंग नजर रखने के लिए एक बहुमुखी उपकरण है। हाल सेल ट्रैकिंग अध्ययन पुनर्योजी चिकित्सा, सूजन या कैंसर 3, 4 के खिलाफ दत्तक सेल चिकित्सा में टी लिम्फोसाइट्स ऑटोलॉगस परिधीय सफेद रक्त कोशिकाओं के संदर्भ में मेसेंकाईमल 1, 2 या अस्थि मज्जा व्युत्पन्न स्टेम सेल 3 पर ध्यान केंद्रित किया। कार्रवाई की साइटों और सेल आधारित चिकित्सा के अंतर्निहित जैविक सिद्धांतों की व्याख्या जबरदस्त महत्व का है। CD8 + साइटोटोक्सिक टी लिम्फोसाइट्स, आनुवंशिक रूप से कैमेरिक प्रतिजन रिसेप्टर (सीएआर) टी कोशिकाओं या ट्यूमर घुसपैठ लिम्फोसाइटों (TILs) व्यापक रूप से सोने के मानक के रूप में माना जाता था इंजीनियर। हालांकि, ट्यूमर जुड़े विशिष्ट प्रतिजन TH1 कोशिकाओं के लिए एक प्रभावी वैकल्पिक उपचार विकल्प 4, साबित हुए हैं </ sup> 5, 6, 7।
कैंसर प्रतिरक्षा चिकित्सा में उच्च ब्याज की कोशिकाओं सूजन में प्रमुख खिलाड़ियों, अंग-विशिष्ट स्व-प्रतिरक्षित बीमारियों (जैसे, गठिया या ब्रोन्कियल अस्थमा), और रूप में, यह TH1 कोशिकाओं के अस्थायी वितरण और होमिंग पैटर्न चिह्नित करने के लिए महत्वपूर्ण है। अवेध्य में vivo इमेजिंग पीईटी द्वारा कोशिका प्रवास पैटर्न की जांच करने के लिए, विवो होमिंग में एक मात्रात्मक, अत्यधिक संवेदनशील तरीका 8 प्रस्तुत करता है, और सूजन, एलर्जी, संक्रमण या ट्यूमर अस्वीकृति 9, 10, 11 के दौरान टी सेल कार्रवाई और प्रतिक्रियाओं की साइटों।
चिकित्सकीय, 111 में oxine, सूजन और संक्रमण 12 के भेदभाव के लिए ल्युकोसैट सिन्टीग्राफी के लिए प्रयोग किया जाता है 2-डिओक्सी-2- (18 जबकिएफ) फ्लोरो डी ग्लूकोज (18 एफ FDG) आमतौर पर पीईटी 3, 13 से सेल ट्रैकिंग अध्ययन के लिए प्रयोग किया जाता है। इस पीईटी ट्रेसर में से एक प्रमुख नुकसान, हालांकि, 109.7 मिनट पर रेडियोन्यूक्लाइड 18 एफ और कम intracellular स्थिरता पोस्ट बाद में समय बिंदुओं पर इमेजिंग दत्तक सेल हस्तांतरण में बाधा उत्पन्न कि से कम आधा जीवन है। पीईटी द्वारा विवो सेल ट्रैकिंग अध्ययन में लंबी अवधि है, हालांकि कोशिकाओं में अस्थिर, 64 Cu-PTSM अक्सर करने के लिए प्रयोग किया जाता है के लिए nonspecifically कोशिकाओं 14, 15 टी सेल व्यवहार्यता पर कम से कम हानिकारक प्रभाव के साथ लेबल और 16 कार्य करते हैं।
यह प्रोटोकॉल एक विधि आगे एक टी सेल रिसेप्टर (TCR) विशिष्ट radiolabeled mAb का उपयोग करके सेल व्यवहार्यता और समारोह पर प्रतिकूल प्रभाव को कम करने का वर्णन है। सबसे पहले, रेडियो आइसोटोप 64 Cu, वें के साथ mAb KJ1-26 के संयोजन के उत्पादनई chelator DOTA, और बाद में 64 Cu-radiolabeling दिखाए जाते हैं। एक दूसरे चरण में, अलगाव और DO11.10 दाता चूहों के कोवा-TH1 कोशिकाओं के विस्तार और 64 Cu-लोडेड DOTA-संयुग्मित mAb KJ1-26 (64 Cu-DOTA-KJ1-26) के साथ radiolabeling विस्तार से वर्णन किया गया है। तेज मूल्यों और एक खुराक अंशशोधक साथ रेडियोधर्मिता का तपका की और गामा गिनती द्वारा क्रमशः मूल्यांकन है, साथ ही trypan नीले अपवर्जन और साथ IFN-गामा एलिसा प्रस्तुत कर रहे हैं कार्यक्षमता द्वारा सेल व्यवहार्यता पर 64 Cu-radiolabeling के प्रभाव का मूल्यांकन । विवो सेल ट्रैकिंग में गैर इनवेसिव के लिए, दत्तक सेल हस्तांतरण के बाद पीईटी / सी टी द्वारा कोवा प्रेरित तीव्र वायु-मार्ग DTHR और छवि अधिग्रहण के एक माउस मॉडल की निकालना वर्णित हैं।
इसके अलावा, इस लेबलिंग दृष्टिकोण अलग रोग मॉडल, विभिन्न TCRs या झिल्ली से बंधा रिसेप्टर्स या अभिव्यक्ति मार्च के साथ ब्याज की सामान्य कोशिकाओं के साथ murine टी कोशिकाओं को हस्तांतरित किया जा सकताkers निरंतर झिल्ली 17 चक्कर अंतर्निहित।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह प्रोटोकॉल एक विश्वसनीय और आसान तरीका स्थिरतापूर्वक पीईटी द्वारा इन विवो ट्रैकिंग के लिए कोशिकाओं radiolabel को प्रस्तुत करता है। इस विधि, कोवा-TH1 कोशिकाओं, पृथक और दाता चूहों से इन विट्रो में विस्त?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों प्रयोगों और डेटा विश्लेषण के दौरान समर्थन के लिए डॉ जूलिया मैनहेम, वॉल्टर एहरलिचमैन, रमोना स्टम, Funda रेती, डेनियल बुकाला, मारेन हारांट के साथ-साथ नेताली एल्टमेयर धन्यवाद। इस काम वार्नर सीमेन्स-फाउंडेशन, SFB685 के माध्यम से DFG (परियोजना बी -6) और भाग्य (2309-0-0) द्वारा समर्थित किया गया।
Materials
| HCl, Suprapur | Merck, Darmstadt, Germany | 1.00318 | 64Cu production |
| Methanol, Suprapur | Merck, Darmstadt, Germany | 1.06007 | 64Cu production |
| Isopropanol, Suprapur | Merck, Darmstadt, Germany | 1.0104 | 64Cu production |
| Pt/Ir (90/10) plate | Ögussa | Custom made | 64Cu production |
| PEEK chamber | Ögussa | Custom made | 64Cu production |
| 64Ni | Chemotrade | 64Cu production | |
| Polygram SIL G/UV 254 plate | Macherey-Nagel | 805021 | 64Cu production |
| Ion exchange column | BioRad | AG1-X8 | 64Cu production |
| Solid state target system for PETtrace | WKL | costum made | 64Cu production |
| 64Cu work-up module | WKL | costum made | 64Cu production |
| Dose calibrator | Capintec | CRC-25R | |
| PETtrace cyclotron | General Electric Medical Systems | ||
| DOTA-NHS | Macrocyclics | B-280 | DOTA-conjugation |
| Anti-cOVA-TCR antibody (KJ1-26) | Isolated from hybridoma cell culture | DOTA-conjugation | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | 71633 | DOTA-conjugation |
| H+ Chelex 100 | Sigma-Aldrich | C7901 | DOTA-conjugation |
| Amicon Ultra-15 filter unit | Merck Millipore | UFC910008 | DOTA-conjugation |
| Rotipuran ultrapure water | Carl Roth | HN68.3 | DOTA-conjugation |
| Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | 32301 | DOTA-conjugation |
| PBS | University Tuebingen | DOTA-conjugation | |
| Micro Bio-spin P-6 column | Bio-Rad Laboratories | 7326221 | DOTA-conjugation |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | 71497 | DOTA-conjugation |
| Cyclone Plus PhosphorImager | Perkin-Elmer | L2250116 | DOTA-conjugation |
| DMEM | Merck Millipore | 102568 | ingredient for T cell medium |
| FCS | Merck Millipore | S0115/1004B | ingredient for T cell medium |
| Sodium pyruvate | Merck Millipore | L0473 | ingredient for T cell medium |
| MEM-amino acids | Merck Millipore | K0293 | ingredient for T cell medium |
| HEPES | Merck Millipore | L 1613 | ingredient for T cell medium |
| Penicillin/Streptomycin | Merck Millipore | A2212 | ingredient for T cell medium |
| 0.05 mM 2-β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | ingredient for T cell medium |
| DO11.10 mice | in-house breeding | TH1 cell culture | |
| DPBS | Gibco | 14190144 | TH1 cell culture |
| Cell strainer 40 µm | Corning | 352340 | TH1 cell culture |
| ACK Lysing Buffer | Lonza | 10-548E | TH1 cell culture |
| CD4 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotech | 130-097-145 | TH1 cell culture |
| QuadroMACS separator | Miltenyi Biotech | 130-090-976 | TH1 cell culture |
| LS column | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | TH1 cell culture |
| anti-CD4 antibody (Gk1.5) | Isolated from hybridoma cell culture | TH1 cell culture | |
| anti-CD8 antibody (5367.2) | Isolated from hybridoma cell culture | TH1 cell culture | |
| Anti-rat antibody (MAR18.5) | Isolated from hybridoma cell culture | TH1 cell culture | |
| Rabbit complement MA | tebu-Bio | CL3221 | TH1 cell culture |
| Anti-IL-4 antibody (11B11) | Isolated from hybridoma cell culture | TH1 cell culture | |
| cOVA 323-339-peptide | EMC-micro-collections | Custom order | TH1 cell culture |
| CPG1668-oligonucleotides | Eurofins MWG Operon | Custom order | TH1 cell culture |
| IL-2 | Novartis | 65483-116-07 | TH1 cell culture |
| 96-well plates | Greiner | 655180 | TH1 cell culture |
| 24-well plates | Greiner | 662160 | TH1 cell culture |
| cell culture flask | Greiner | 660175 | TH1 cell culture |
| 48-well plates | Greiner | 677 180 | cell labeling |
| Gammacell 1000 | Best Theratronics | via inquiry | |
| Gulmay RT225 | Gulmay | via inquiry | |
| Trypan blue | Merck Millipore | L6323 | in vitro evaluation |
| Mouse IFN-γ ELISA | BD Biosciences | 558258 | in vitro evaluation |
| PE Annexin V Apoptosis Detection Kit | BD Biosciences | 559763 | in vitro evaluation |
| Tube 5 ml | Sarstedt | 55.476 | in vitro evaluation |
| Round-bottom tubes | BD Biosciences | 352008 | in vitro evaluation |
| Wizard γ-counter | Perkin-Elmer | 2480-0010 | in vitro evaluation |
| ELISA Reader MultiscanEX | Thermo Fisher Scientific | 51118177 | in vitro evaluation |
| Microscope | Leica | via inquiry | in vitro evaluation |
| BD LSRII | BD Biosciences | via inquiry | in vitro evaluation |
| BALB/c mice | Charles River | 028 | in vivo cell trafficking |
| Aluminum gel | Serva Electrophoresis | 12261.01 | in vivo cell trafficking |
| Xylazine | Bayer HealthCare | Ordered via University hospital | in vivo cell trafficking |
| Ketamine | Ratiopharm | Ordered via University hospital | in vivo cell trafficking |
| Isoflurane | CP-Pharma | Ordered via University hospital | in vivo cell trafficking |
| 30G needle | BD Biosciences | 304000 | in vivo cell trafficking |
| Syringe | BD Biosciences | 11612491 | in vivo cell trafficking |
| Capillaries 10 µl | VWR | 612-2439 | |
| Inveon PET scanner | Siemens Healthineers | no longer available | in vivo cell trafficking, alternative companies: Bruker, Mediso |
| Inveon SPECT/CT scanner | Siemens Healthineers | no longer available | in vivo cell trafficking |
| Inveon Research Workplace | Siemens Healthineers | image analysis, alternative software: Pmod |
References
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