بعد إعداد الأجسام المضادة وحيدة النسيلة 64 النحاس تعديل ملزم لالفئران المعدلة وراثيا مستقبلات الخلايا التائية والخلايا T هي رديولبلد في الجسم الحي، وتحليلها للبقاء، وظائف، والاستقرار ووضع العلامات وموت الخلايا المبرمج، ونقلت adoptively في الفئران مع مجرى الهواء من نوع تأخر فرط الحساسية رد فعل للتصوير غير الغازية التي كتبها التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني / التصوير المقطعي (PET / CT).
يوضح هذا البروتوكول إنتاج 64 النحاس وخالب اقتران / radiolabeling من الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (ماب) تليها زراعة الخلايا اللمفاوية الفئران ومستقبلات 64 النحاس والأجسام المضادة التي تستهدف الخلايا. في تقييم المختبر من موصوفة في radiolabel وغير الغازية في تعقب خلية الجسم الحي في نموذج حيواني لمجرى الهواء من نوع تأخر فرط الحساسية رد فعل (DTHR) من خلال PET / CT.
في التفاصيل، يظهر الاقتران من ماب مع خالب حمض 1،4،7،10-tetraazacyclododecane-1،4،7،10-tetraacetic (DOTA). بعد إنتاج المشع 64 النحاس، radiolabeling من ماب DOTA مترافق يوصف. التالي، والتوسع في ألبومين البيض الدجاج (كوفا) CD4 + محددة فيروسات (IFN) -γ المنتجة وصفت خلايا T المساعدة (كوفا-TH1) وradiolabeling اللاحقة من الخلايا كوفا-TH1. وتعرض مختلف في المختبر تقنيات لتقييم القوة التنفيذيةتأثيرات سلبية من 64 النحاس وradiolabeling على الخلايا، مثل تحديد بقاء الخلية التي الاستبعاد التريبان الأزرق، وتلطيخ لموت الخلايا المبرمج مع Annexin V لالتدفق الخلوي، وتقييم الأداء الوظيفي عن طريق الإنترفيرون جاما فحص انزيم مرتبط المناعي (ELISA) . علاوة على ذلك، وصف تقرير لامتصاص المشع في الخلايا والاستقرار وصفها بالتفصيل. يصف هذا البروتوكول كذلك كيفية تنفيذ دراسات تتبع خلية في نموذج حيواني لDTHR مجرى الهواء، وبالتالي، يتم تضمين تحريض الناجم عن كوفا-DHTR الهوائية الحاد في BALB / ج الفئران. وأخيرا، قدم قوي PET / CT سير العمل بما في ذلك الحصول على الصور، وإعادة الإعمار، والتحليل.
مستقبلات استهداف نهج 64 النحاس والأجسام المضادة مع استيعاب مستقبلات لاحق يوفر خصوصية عالية والاستقرار، وانخفاض السمية الخلوية، ومعدلات هروب رأس المال منخفضة مقارنة PET-استشفاف مشتركة لوضع العلامات الخلية، وعلى سبيل المثال 64 النحاسمكرر -pyruvaldehyde (N4-methylthiosemicarbazone) (64 النحاس وPTSM). وأخيرا، نهجنا تمكن غير الغازية في تعقب خلية الحي بواسطة PET / CT مع النسبة المثلى الإشارة إلى خلفية لمدة 48 ساعة. يمكن نقل هذا المنهج التجريبي لنماذج حيوانية وأنواع مختلفة من الخلايا مع مستقبلات محددة غشاء التي يتم استيعابها.
تتبع الخلية غير الغازية هو أداة مرنة لمراقبة وظيفة الخلية والهجرة وصاروخ موجه في الجسم الحي. وقد ركزت دراسات تتبع الخلية الأخيرة على الوسيطة 1 أو 2 أو نخاع العظم الخلايا الجذعية المستمدة 3 في سياق الطب التجديدي، ذاتي الطرفية خلايا الدم البيضاء في التهاب أو الخلايا الليمفاوية T في العلاج بالخلايا بالتبني ضد السرطان 3 و 4. توضيح من مواقع العمل والمبادئ البيولوجية الكامنة وراء العلاجات المستندة إلى الخلايا له أهمية هائلة. CD8 + T السامة للخلايا الليمفاوية، وراثيا خيالية مستضد مستقبلات (CAR) خلايا T أو الخلايا الليمفاوية التسلل الورم (TILs) اعتبرت على نطاق واسع عن معيار الذهب. ومع ذلك، فقد أثبتت خلايا TH1 مستضد معين المرتبطة الورم ليكون خيار علاجي بديل فعال 4، </ sup> في 5 و 6 و 7.
كما دورا رئيسيا في التهاب وأمراض المناعة الذاتية، جهاز معين (على سبيل المثال، والتهاب المفاصل أو الربو القصبي)، وخلايا الفائدة المرتفعة في العلاج المناعي السرطان، من المهم أن تميز التوزيع وصاروخ موجه الأنماط الزمنية من خلايا TH1. موسع في الجسم الحي التصوير بواسطة PET يعرض الكمي، طريقة حساسة للغاية 8 لدراسة أنماط هجرة الخلية، في صاروخ موجه الجسم الحي، ومواقع عمل الخلايا T والاستجابات أثناء الالتهاب، والحساسية، والالتهابات أو الرفض الورم 9 و 10 و 11.
سريريا، و 111 في وoxine يستخدم لمضان الكريات البيض لتمييز الالتهاب والعدوى 12، في حين أن 2-ديوكسي-2- (18يستخدم F) الفلوري-D-الجلوكوز (18 F-FDG) عادة للدراسات تتبع الخلية PET 3، 13. واحد العيب الرئيسي لهذا التتبع PET، ومع ذلك، هو نصف عمر قصير من النويدات المشعة 18 F في 109.7 دقيقة والاستقرار داخل الخلايا المنخفض الذي يعوق التصوير في نقاط زمنية لاحقة نشر نقل خلية بالتبني. لفترة أطول في دراسات تتبع خلية الجسم الحي بواسطة PET، على الرغم من عدم الاستقرار في الخلايا، وكثيرا ما يستخدم 64 النحاس وPTSM إلى nonspecifically تسمية الخلايا 14 و 15 مع التقليل من الآثار الضارة على الخلايا T الجدوى وتعمل 16.
يصف هذا البروتوكول وسيلة لزيادة خفض آثار غير مواتية على بقاء الخلية وظيفة باستخدام مستقبلات الخلايا التائية (TCR) محددة رديولبلد ماب. أولا، وإنتاج النظائر المشعة 64 النحاس، والاقتران من ماب KJ1-26 مع الوتظهر البريد خالب DOTA، واللاحقة 64 النحاس وradiolabeling. في الخطوة الثانية، يتم وصف العزلة وتوسيع خلايا كوفا-TH1 من الفئران المانحة DO11.10 وradiolabeling مع 64 تحميل النحاس و-DOTA مترافق ماب KJ1-26 (64 النحاس وDOTA-KJ1-26) بالتفصيل. تقييم القيم امتصاص وهروب رأس المال من الإشعاعي مع معاير جرعة وجاما العد والفرز، على التوالي، فضلا عن تقييم آثار 64 النحاس وradiolabeling على بقاء الخلية التي الاستبعاد التريبان الأزرق وظائف مع تعرض ELISA-جاما IFN . لغير الغازية في تعقب الخلايا في الجسم الحي، وصفت الاستنباط من نموذج الفأر من الناجم عن كوفا-الهوائية الحاد DTHR والحصول على الصور من قبل PET / CT بعد نقل الخلايا بالتبني.
وعلاوة على ذلك، فإن هذا النهج وضع العلامات يمكن نقلها إلى نماذج مرضية مختلفة، وخلايا T الفئران مع TCRs مختلفة أو خلايا العامة في المصالح مع مستقبلات غشاء محدد أو مارس التعبيراستعادة الطاقة الحركية الأساسية غشاء المستمر في رحلات مكوكية 17.
يعرض هذا البروتوكول طريقة موثوقة وسهلة لradiolabel مستقر الخلايا في الجسم الحي تتبع من قبل PET. باستخدام هذه الطريقة، وخلايا كوفا-TH1، معزولة وتوسعت في المختبر من الفئران المانحة، يمكن أن يكون رديولبلد مع 64 النحاس وDOTA-KJ1-26-ماب وصاروخ موجه من كانت تتبع لLNS الرئ?…
The authors have nothing to disclose.
الكتاب أشكر الدكتورة جوليا مانهايم، ووالتر إهرليشمان، رامونا ستوم، فوندا كاي، دانيال بوكالا، مارين هارانت وكذلك ناتالي ألتمير للدعم خلال تحليل التجارب والبيانات. وأيد هذا العمل من قبل فيرنر سيمنس-مؤسسة، وDFG من خلال SFB685 (B6 المشروع) والثروة (2309-0-0).
HCl, Suprapur | Merck, Darmstadt, Germany | 1.00318 | 64Cu production |
Methanol, Suprapur | Merck, Darmstadt, Germany | 1.06007 | 64Cu production |
Isopropanol, Suprapur | Merck, Darmstadt, Germany | 1.0104 | 64Cu production |
Pt/Ir (90/10) plate | Ögussa | Custom made | 64Cu production |
PEEK chamber | Ögussa | Custom made | 64Cu production |
64Ni | Chemotrade | 64Cu production | |
Polygram SIL G/UV 254 plate | Macherey-Nagel | 805021 | 64Cu production |
Ion exchange column | BioRad | AG1-X8 | 64Cu production |
Solid state target system for PETtrace | WKL | costum made | 64Cu production |
64Cu work-up module | WKL | costum made | 64Cu production |
Dose calibrator | Capintec | CRC-25R | |
PETtrace cyclotron | General Electric Medical Systems | ||
DOTA-NHS | Macrocyclics | B-280 | DOTA-conjugation |
Anti-cOVA-TCR antibody (KJ1-26) | Isolated from hybridoma cell culture | DOTA-conjugation | |
Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | 71633 | DOTA-conjugation |
H+ Chelex 100 | Sigma-Aldrich | C7901 | DOTA-conjugation |
Amicon Ultra-15 filter unit | Merck Millipore | UFC910008 | DOTA-conjugation |
Rotipuran ultrapure water | Carl Roth | HN68.3 | DOTA-conjugation |
Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | 32301 | DOTA-conjugation |
PBS | University Tuebingen | DOTA-conjugation | |
Micro Bio-spin P-6 column | Bio-Rad Laboratories | 7326221 | DOTA-conjugation |
Sodium citrate | Sigma-Aldrich | 71497 | DOTA-conjugation |
Cyclone Plus PhosphorImager | Perkin-Elmer | L2250116 | DOTA-conjugation |
DMEM | Merck Millipore | 102568 | ingredient for T cell medium |
FCS | Merck Millipore | S0115/1004B | ingredient for T cell medium |
Sodium pyruvate | Merck Millipore | L0473 | ingredient for T cell medium |
MEM-amino acids | Merck Millipore | K0293 | ingredient for T cell medium |
HEPES | Merck Millipore | L 1613 | ingredient for T cell medium |
Penicillin/Streptomycin | Merck Millipore | A2212 | ingredient for T cell medium |
0.05 mM 2-β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | ingredient for T cell medium |
DO11.10 mice | in-house breeding | TH1 cell culture | |
DPBS | Gibco | 14190144 | TH1 cell culture |
Cell strainer 40 µm | Corning | 352340 | TH1 cell culture |
ACK Lysing Buffer | Lonza | 10-548E | TH1 cell culture |
CD4 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotech | 130-097-145 | TH1 cell culture |
QuadroMACS separator | Miltenyi Biotech | 130-090-976 | TH1 cell culture |
LS column | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | TH1 cell culture |
anti-CD4 antibody (Gk1.5) | Isolated from hybridoma cell culture | TH1 cell culture | |
anti-CD8 antibody (5367.2) | Isolated from hybridoma cell culture | TH1 cell culture | |
Anti-rat antibody (MAR18.5) | Isolated from hybridoma cell culture | TH1 cell culture | |
Rabbit complement MA | tebu-Bio | CL3221 | TH1 cell culture |
Anti-IL-4 antibody (11B11) | Isolated from hybridoma cell culture | TH1 cell culture | |
cOVA 323-339-peptide | EMC-micro-collections | Custom order | TH1 cell culture |
CPG1668-oligonucleotides | Eurofins MWG Operon | Custom order | TH1 cell culture |
IL-2 | Novartis | 65483-116-07 | TH1 cell culture |
96-well plates | Greiner | 655180 | TH1 cell culture |
24-well plates | Greiner | 662160 | TH1 cell culture |
cell culture flask | Greiner | 660175 | TH1 cell culture |
48-well plates | Greiner | 677 180 | cell labeling |
Gammacell 1000 | Best Theratronics | via inquiry | |
Gulmay RT225 | Gulmay | via inquiry | |
Trypan blue | Merck Millipore | L6323 | in vitro evaluation |
Mouse IFN-γ ELISA | BD Biosciences | 558258 | in vitro evaluation |
PE Annexin V Apoptosis Detection Kit | BD Biosciences | 559763 | in vitro evaluation |
Tube 5 ml | Sarstedt | 55.476 | in vitro evaluation |
Round-bottom tubes | BD Biosciences | 352008 | in vitro evaluation |
Wizard γ-counter | Perkin-Elmer | 2480-0010 | in vitro evaluation |
ELISA Reader MultiscanEX | Thermo Fisher Scientific | 51118177 | in vitro evaluation |
Microscope | Leica | via inquiry | in vitro evaluation |
BD LSRII | BD Biosciences | via inquiry | in vitro evaluation |
BALB/c mice | Charles River | 028 | in vivo cell trafficking |
Aluminum gel | Serva Electrophoresis | 12261.01 | in vivo cell trafficking |
Xylazine | Bayer HealthCare | Ordered via University hospital | in vivo cell trafficking |
Ketamine | Ratiopharm | Ordered via University hospital | in vivo cell trafficking |
Isoflurane | CP-Pharma | Ordered via University hospital | in vivo cell trafficking |
30G needle | BD Biosciences | 304000 | in vivo cell trafficking |
Syringe | BD Biosciences | 11612491 | in vivo cell trafficking |
Capillaries 10 µl | VWR | 612-2439 | |
Inveon PET scanner | Siemens Healthineers | no longer available | in vivo cell trafficking, alternative companies: Bruker, Mediso |
Inveon SPECT/CT scanner | Siemens Healthineers | no longer available | in vivo cell trafficking |
Inveon Research Workplace | Siemens Healthineers | image analysis, alternative software: Pmod |