Muizen-lymfocyt Labeling door<sup> 64</sup> Cu-Antibody Receptor targeting voor<em> In Vivo</em> Celverkeer PET / CT
Summary
Na de bereiding van een 64 Cu-gemodificeerd monoklonaal antilichaam dat aan een transgene muizen T-celreceptor, T-cellen radiogelabeld in vivo geanalyseerd op levensvatbaarheid functionaliteit labeling stabiliteit en apoptose en adoptief overgebracht in muizen met een luchtweg vertraagde hypersensitiviteit reactie voor niet-invasieve beeldvorming met positron emission tomography / computed tomography (PET / CT).
Abstract
Dit protocol illustreert de bereiding van 64 Cu en de chelator conjugatie / radioactief labelen van een monoklonaal antilichaam (mAb) gevolgd door muizen lymfocyt celkweek en 64 Cu-antilichaamreceptor targeting van cellen. In vitro evaluatie van het radiolabel en niet-invasief in vivo cell tracking in een diermodel van een luchtweg vertraagd type overgevoeligheidsreactie (DTHR) PET / CT beschreven.
In detail wordt de conjugatie van een mAb met de chelator 1,4,7,10-tetraazacyclododecaan-1,4,7,10-tetraazijnzuur (DOTA) weergegeven. Na de productie van radioactief 64 Cu, radiolabeling van de DOTA-geconjugeerde mAb beschreven. Vervolgens wordt de groei van kippen ovalbumine (COVA) -specifieke CD4 + interferon (IFN) -γ-producerende T helpercellen (cova-TH1) en de daaropvolgende radiolabeling van cova-TH1-cellen zijn afgebeeld. Verschillende in vitro technieken worden aan de ef evaluerenfects 64 Cu-radioactief merken van de cellen, zoals het bepalen van de cellevensvatbaarheid door trypan blauw exclusie, de kleuring voor apoptosis met Annexine V voor flowcytometrie en de beoordeling van de functionaliteit van IFN-γ-enzymgebonden immunosorbent assay (ELISA) . Bovendien is de bepaling van de radioactieve opname in de cellen en de etikettering stabiliteit beschreven. Dit protocol beschrijft verder hoe cell tracking studies uit te voeren in een diermodel voor de luchtwegen DTHR en derhalve wordt de inductie van cova-geïnduceerde acute luchtwegen VHTR bij BALB / c-muizen inbegrepen. Tenslotte wordt een robuuste PET / CT workflow inclusief beeldacquisitie, reconstructie en analyse weergegeven.
De 64 Cu-antilichaamreceptor targeting benadering daaropvolgende receptor internalisatie biedt een hoge specificiteit en stabiliteit, verminderde cellulaire toxiciteit en lage uitstroom tarieven in vergelijking met gewone PET-tracers voor cellulaire labelen, bijvoorbeeld 64 Cu-pyruvaldehyde bis (N4-methylthiosemicarbazone) (64 Cu-PTSM). Tenslotte onze aanpak maakt non-invasief in vivo cell tracking PET / CT met een optimale signaal-achtergrond-verhouding voor 48 uur. Deze experimentele benadering kan worden overgedragen op verschillende diermodellen en celtypen met membraangebonden receptoren die worden geïnternaliseerd.
Introduction
Niet-invasieve cell tracking is een veelzijdige tool om celfunctie, migratie en homing in vivo te controleren. Recente cell tracking studies zijn gericht op mesenchymale 1, 2 of beenmerg afgeleide stamcellen 3 in het kader van de regeneratieve geneeskunde, autologe perifere witte bloedcellen in ontsteking of T-lymfocyten in adoptieve celtherapie tegen kanker 3, 4. De opheldering van de sites van de actie en de onderliggende biologische principes van cellen gebaseerde therapieën is van enorm belang. CD8 + cytotoxische T-lymfocyten, genetisch gemanipuleerd chimeer antigen receptor (CAR) T-cellen of tumor infiltrerende lymfocyten (TIL's) werden algemeen beschouwd als de gouden standaard. Echter, tumor geassocieerde antigen-specifieke TH1 cellen bewezen een effectief alternatief behandelingsoptie 4, zijn </ sup> 5, 6, 7.
Als belangrijkste spelers in ontsteking, orgaan-specifieke auto-immuunziekten (zoals reumatoïde artritis of astma), en cellen van grote belangstelling voor immunotherapie van kanker, is het belangrijk om de tijdelijke distributie en homing patronen van Th1-cellen te karakteriseren. Invasieve in vivo imaging PET weer kwantitatief, uiterst gevoelige methode 8 celmigratie patronen onderzoeken in vivo homing en het plaatsen van T-cel responsen tijdens actie en ontsteking, allergieën, infecties of tumor-afstotende 9, 10, 11.
Klinisch 111In-oxine wordt gebruikt om leukocyten scintigrafie voor het onderscheiden van ontsteking en infectie 12, terwijl 2-deoxy-2- (18F) fluor-D-glucose (18F-FDG) wordt algemeen gebruikt voor cellulaire tracking studies PET 3, 13. Een belangrijk nadeel van deze PET tracer, echter de korte halfwaardetijd van de radionuclide 18F bij 109,7 min en de lage intracellulaire stabiliteit die belemmert beeldvorming op latere tijdstippen na adoptieve celoverdracht. Voor langere termijn in vivo cell tracking studies van PET, maar instabiel in de cellen, wordt 64 Cu-PTSM vaak gebruikt om niet-specifiek label cellen 14, 15 met minimale nadelige effecten op T cellevensvatbaarheid en functie 16.
Dit protocol beschrijft een werkwijze om nadelige effecten op cellevensvatbaarheid en functie in een T-celreceptor (TCR) -specifieke radiogelabelde mAb verder te verminderen. Ten eerste, de productie van radio-isotopen 64 Cu, de vervoeging van het mAb KJ1-26 met the chelator DOTA en de daaropvolgende 64 Cu-radioactief labelen getoond. In een tweede stap, de isolatie en expansie van cova-TH1 cellen van DO 11.10 donormuizen en het radioactief merken met 64 Cu-loaded DOTA-geconjugeerde mAb KJ1-26 (64 Cu-DOTA-KJ1-26) worden beschreven. De beoordeling van opnamewaarden en efflux van radioactiviteit met een dosiskalibrator en door y-telling, respectievelijk, en de evaluatie van de effecten van 64 Cu-radioactief merken op cellevensvatbaarheid door trypan blauw exclusie en functionaliteit met IFN-y ELISA worden . Voor niet-invasief in vivo cell tracking, het uitlokken van een muismodel van cova-geïnduceerde acute luchtwegen DTHR en beeldacquisitie PET / CT na adoptieve celoverdracht beschreven.
Bovendien kan deze benadering worden labeling doorgezet naar verschillende ziektemodellen murine T-cellen met verschillende TCR of algemene cellen plaats met membraangebonden receptoren of expressie markers onderliggende continu membraan 17 pendelen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol geeft een betrouwbare en eenvoudige methode om stabiel radioactief cellen in vivo volgen van PET. Gebruik makend van deze methode, cova-TH1 cellen geïsoleerd en geëxpandeerd in vitro uit donor muizen kon worden radiogelabeld met 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb en de homing werd gevolgd aan de longen perithymic LN als gebieden van COVA presentatie in een Cova-geïnduceerde acute luchtweg DTHR.
De modificatie van het mAb met de chelator vereist een snelle en e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs danken dr Julia Mannheim, Walter Ehrlichmann, Ramona Stumm, Funda Cay, Daniel Bukala, Maren Harant evenals Natalie Altmeyer voor de steun tijdens de experimenten en data-analyse. Dit werk werd ondersteund door de Werner Siemens-Stichting, de DFG door de SFB685 (project B6) en Fortune (2309-0-0).
Materials
| HCl, Suprapur | Merck, Darmstadt, Germany | 1.00318 | 64Cu production |
| Methanol, Suprapur | Merck, Darmstadt, Germany | 1.06007 | 64Cu production |
| Isopropanol, Suprapur | Merck, Darmstadt, Germany | 1.0104 | 64Cu production |
| Pt/Ir (90/10) plate | Ögussa | Custom made | 64Cu production |
| PEEK chamber | Ögussa | Custom made | 64Cu production |
| 64Ni | Chemotrade | 64Cu production | |
| Polygram SIL G/UV 254 plate | Macherey-Nagel | 805021 | 64Cu production |
| Ion exchange column | BioRad | AG1-X8 | 64Cu production |
| Solid state target system for PETtrace | WKL | costum made | 64Cu production |
| 64Cu work-up module | WKL | costum made | 64Cu production |
| Dose calibrator | Capintec | CRC-25R | |
| PETtrace cyclotron | General Electric Medical Systems | ||
| DOTA-NHS | Macrocyclics | B-280 | DOTA-conjugation |
| Anti-cOVA-TCR antibody (KJ1-26) | Isolated from hybridoma cell culture | DOTA-conjugation | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | 71633 | DOTA-conjugation |
| H+ Chelex 100 | Sigma-Aldrich | C7901 | DOTA-conjugation |
| Amicon Ultra-15 filter unit | Merck Millipore | UFC910008 | DOTA-conjugation |
| Rotipuran ultrapure water | Carl Roth | HN68.3 | DOTA-conjugation |
| Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | 32301 | DOTA-conjugation |
| PBS | University Tuebingen | DOTA-conjugation | |
| Micro Bio-spin P-6 column | Bio-Rad Laboratories | 7326221 | DOTA-conjugation |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | 71497 | DOTA-conjugation |
| Cyclone Plus PhosphorImager | Perkin-Elmer | L2250116 | DOTA-conjugation |
| DMEM | Merck Millipore | 102568 | ingredient for T cell medium |
| FCS | Merck Millipore | S0115/1004B | ingredient for T cell medium |
| Sodium pyruvate | Merck Millipore | L0473 | ingredient for T cell medium |
| MEM-amino acids | Merck Millipore | K0293 | ingredient for T cell medium |
| HEPES | Merck Millipore | L 1613 | ingredient for T cell medium |
| Penicillin/Streptomycin | Merck Millipore | A2212 | ingredient for T cell medium |
| 0.05 mM 2-β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | ingredient for T cell medium |
| DO11.10 mice | in-house breeding | TH1 cell culture | |
| DPBS | Gibco | 14190144 | TH1 cell culture |
| Cell strainer 40 µm | Corning | 352340 | TH1 cell culture |
| ACK Lysing Buffer | Lonza | 10-548E | TH1 cell culture |
| CD4 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotech | 130-097-145 | TH1 cell culture |
| QuadroMACS separator | Miltenyi Biotech | 130-090-976 | TH1 cell culture |
| LS column | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | TH1 cell culture |
| anti-CD4 antibody (Gk1.5) | Isolated from hybridoma cell culture | TH1 cell culture | |
| anti-CD8 antibody (5367.2) | Isolated from hybridoma cell culture | TH1 cell culture | |
| Anti-rat antibody (MAR18.5) | Isolated from hybridoma cell culture | TH1 cell culture | |
| Rabbit complement MA | tebu-Bio | CL3221 | TH1 cell culture |
| Anti-IL-4 antibody (11B11) | Isolated from hybridoma cell culture | TH1 cell culture | |
| cOVA 323-339-peptide | EMC-micro-collections | Custom order | TH1 cell culture |
| CPG1668-oligonucleotides | Eurofins MWG Operon | Custom order | TH1 cell culture |
| IL-2 | Novartis | 65483-116-07 | TH1 cell culture |
| 96-well plates | Greiner | 655180 | TH1 cell culture |
| 24-well plates | Greiner | 662160 | TH1 cell culture |
| cell culture flask | Greiner | 660175 | TH1 cell culture |
| 48-well plates | Greiner | 677 180 | cell labeling |
| Gammacell 1000 | Best Theratronics | via inquiry | |
| Gulmay RT225 | Gulmay | via inquiry | |
| Trypan blue | Merck Millipore | L6323 | in vitro evaluation |
| Mouse IFN-γ ELISA | BD Biosciences | 558258 | in vitro evaluation |
| PE Annexin V Apoptosis Detection Kit | BD Biosciences | 559763 | in vitro evaluation |
| Tube 5 ml | Sarstedt | 55.476 | in vitro evaluation |
| Round-bottom tubes | BD Biosciences | 352008 | in vitro evaluation |
| Wizard γ-counter | Perkin-Elmer | 2480-0010 | in vitro evaluation |
| ELISA Reader MultiscanEX | Thermo Fisher Scientific | 51118177 | in vitro evaluation |
| Microscope | Leica | via inquiry | in vitro evaluation |
| BD LSRII | BD Biosciences | via inquiry | in vitro evaluation |
| BALB/c mice | Charles River | 028 | in vivo cell trafficking |
| Aluminum gel | Serva Electrophoresis | 12261.01 | in vivo cell trafficking |
| Xylazine | Bayer HealthCare | Ordered via University hospital | in vivo cell trafficking |
| Ketamine | Ratiopharm | Ordered via University hospital | in vivo cell trafficking |
| Isoflurane | CP-Pharma | Ordered via University hospital | in vivo cell trafficking |
| 30G needle | BD Biosciences | 304000 | in vivo cell trafficking |
| Syringe | BD Biosciences | 11612491 | in vivo cell trafficking |
| Capillaries 10 µl | VWR | 612-2439 | |
| Inveon PET scanner | Siemens Healthineers | no longer available | in vivo cell trafficking, alternative companies: Bruker, Mediso |
| Inveon SPECT/CT scanner | Siemens Healthineers | no longer available | in vivo cell trafficking |
| Inveon Research Workplace | Siemens Healthineers | image analysis, alternative software: Pmod |
References
- Cerri, S., et al. Intracarotid Infusion of Mesenchymal Stem Cells in an Animal Model of Parkinson’s Disease, Focusing on Cell Distribution and Neuroprotective and Behavioral Effects. Stem Cells Trans Med. 4 (9), 1073-1085 (2015).
- Hasenbach, K., et al. Monitoring the glioma tropism of bone marrow-derived progenitor cells by 2-photon laser scanning microscopy and positron emission tomography. Neuro Oncol. 14 (4), 471-481 (2012).
- Sood, V., et al. Biodistribution of 18F-FDG-Labeled Autologous Bone Marrow – Derived Stem Cells in Patients With Type 2 Diabetes Mellitus. Clin Nucl Med. 40 (9), 697-700 (2015).
- Perez-Diez, A., et al. CD4 cells can be more efficient at tumor rejection than CD8 cells. Blood. 109 (12), 5346-5354 (2007).
- Muranski, P., Restifo, N. P. Adoptive immunotherapy of cancer using CD4+ T cells. Curr. Opin. Immunol. 21 (2), 200-208 (2009).
- Braumuller, H., et al. T-helper-1-cell cytokines drive cancer into senescence. Nature. 494 (7437), 361-365 (2013).
- Kochenderfer, J. N., et al. Eradication of B-lineage cells and regression of lymphoma in a patient treated with autologous T cells genetically engineered to recognize CD19. Blood. 116 (20), 4099-4102 (2010).
- Cherry, S. R. Fundamentals of Positron Emission Tomography and Applications in Preclinical Drug Development. J. Clin. Pharmacol. 41 (5), 482-491 (2001).
- Tavaré, R., et al. An Effective Immuno-PET Imaging Method to Monitor CD8-Dependent Responses to Immunotherapy. Cancer Res. 76 (1), 73-82 (2016).
- Tavaré, R., et al. Engineered antibody fragments for immuno-PET imaging of endogenous CD8+ T cells in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (3), 1108-1113 (2014).
- Dobrenkov, K., et al. Monitoring the Efficacy of Adoptively Transferred Prostate Cancer-Targeted Human T Lymphocytes with PET and Bioluminescence Imaging. J Nucl Med. 49 (7), 1162-1170 (2008).
- Rini, J. N., et al. PET with FDG-labeled Leukocytes versus Scintigraphy with 111In-Oxine-labeled Leukocytes for Detection of Infection. Radiology. 238 (3), 978-987 (2006).
- Ritchie, D., et al. In vivo tracking of macrophage activated killer cells to sites of metastatic ovarian carcinoma. Cancer Immunol. Immunother. 56 (2), 155-163 (2006).
- Adonai, N., et al. Ex vivo cell labeling with 64Cu-pyruvaldehyde-bis(N4-methylthiosemicarbazone) for imaging cell trafficking in mice with positron-emission tomography. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (5), 3030-3035 (2002).
- Huang, J., Lee, C. C. I., Sutcliffe, J. L., Cherry, S. R., Tarantal, A. F. Radiolabeling Rhesus Monkey CD34+ Hematopoietic and Mesenchymal Stem Cells with 64Cu-Pyruvaldehyde-Bis(N4-Methylthiosemicarbazone) for MicroPET Imaging. Mol. Imaging. 7 (1), (2008).
- Griessinger, C. M., et al. In Vivo Tracking of Th1 Cells by PET Reveals Quantitative and Temporal Distribution and Specific Homing in Lymphatic Tissue. J Nucl Med. 55 (2), 301-307 (2014).
- Griessinger, C. M., et al. 64Cu antibody-targeting of the T-cell receptor and subsequent internalization enables in vivo tracking of lymphocytes by PET. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (4), 1161-1166 (2015).
- McCarthy, D. W., et al. Efficient production of high specific activity 64Cu using a biomedical cyclotron. Nucl. Med. Biol. 24 (1), 35-43 (1997).
- Kalkhof, S., Sinz, A. Chances and pitfalls of chemical cross-linking with amine-reactive N-hydroxysuccinimide esters. Anal. Bioanal. Chem. 392 (1), 305-312 (2008).
- Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin Iii, ., J, Isolation and Th17 Differentiation of Naive CD4 T Lymphocytes. J Vis Exp. (79), e50765 (2013).
- Flaherty, S., Reynolds, J. M. Mouse Naive CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets. J Vis Exp. (98), e52739 (2015).
- Judenhofer, M., Wiehr, S., Kukuk, D., Fischer, K., Pichler, B. Chapter 363. Small Animal Imaging. Basics and Practical Guide. , 363-370 (2011).
- Phelps, M. E. . PET. Molecular Imaging and Its Biological Applications. , 93-101 (2004).
- Wu, A. M. Antibodies and Antimatter: The Resurgence of Immuno-PET. JNM. 50 (1), 2-5 (2009).
- Lewis, M. R., et al. In vivo evaluation of pretargeted 64Cu for tumor imaging and therapy. J Nucl Med. 44 (8), 1284-1292 (2003).
- Boswell, C. A., et al. Comparative in vivo stability of copper-64-labeled cross-bridged and conventional tetraazamacrocyclic complexes. J Med Chem. 47 (6), 1465-1474 (2004).
- Ghosh, S. C., et al. Comparison of DOTA and NODAGA as chelators for (64)Cu-labeled immunoconjugates. Nucl Med Biol. 42 (2), 177-183 (2015).
- Johnson, T. E., Birky, B. K. . Health Physics and Radiological Health. , (2011).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Meth. 2 (12), 932-940 (2005).
