Summary

Los análisis de linaje celular y el gen de Estudios de la función Uso MARCM Twin-situ

Published: March 02, 2017
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Summary

Aquí, se presenta un protocolo para una técnica de etiquetado mosaico que permite la visualización de las neuronas derivadas de una célula progenitora común en dos colores distintos. Esto facilita el análisis de linaje neural con la capacidad de las neuronas individuales de nacimiento actualización y el estudio de la función de genes en las mismas neuronas de diferentes individuos.

Abstract

M osaic un nálisis con un r epressible c ell m Arker (MARCM) es un sistema de etiquetado mosaico positivo que se ha aplicado ampliamente en Drosophila estudios neurobiológicos para representar intrincados morfologías y manipular la función de los genes en subconjuntos de neuronas dentro de otra manera sin marcar y no perturbado organismos. mosaicos genéticos generados en el sistema MARCM están mediados a través de la recombinación específica de sitio entre cromosomas homólogos dentro de la división de las células precursoras para producir ambos marcados (clones MARCM) y células hijas durante la mitosis sin marcar. Una extensión del método MARCM, llamado MARCM de doble punto (tsMARCM), etiquetas, tanto de las células individuales derivados de un antepasado común con dos colores distintos. Esta técnica fue desarrollada para permitir la recuperación de información útil a partir de los dos hemi-linajes. Por exhaustivamente el análisis de diferentes pares de clones tsMARCM, el sistema permite tsMARCM de alta resolución linaje neuronal mapping para revelar la exacta orden de nacimiento de las neuronas marcadas producidos a partir de células progenitoras comunes. Además, el sistema también se extiende tsMARCM estudios de la función de genes permitiendo que el análisis fenotípico de las neuronas idénticas de diferentes animales. A continuación, describimos cómo aplicar el sistema tsMARCM para facilitar los estudios de desarrollo neural en Drosophila.

Introduction

El cerebro, compuesto de un gran número y diversidad de tipos de neuronas, dota a los animales con la capacidad de percibir, procesar y responder a los desafíos del mundo externo. Las neuronas del adulto Drosophila cerebro central se derivan de un número limitado de células madre neuronales, llamadas neuroblastos (NBS), durante el desarrollo 1, 2. La mayor parte del NBS participar en la neurogénesis del cerebro en Drosophila someterse a la división asimétrica para generar RN auto-renovación y células madre ganglio (GMCs), y los GMC y luego ir a través de otra ronda de división para producir dos células hijas que se diferencian en neuronas 3 (Figura 1A ). Debido a la complejidad de la morfología neuronal y los retos asociados con la identificación de las neuronas específicas, una tecnología de etiquetado mosaico positivo, análisis de mosaico con un marcador de células que se puede reprimir (MARCM), fue inventado para que el visualization de una sola neurona o un pequeño subconjunto de neuronas de la población de neuronas, sin etiqueta alrededores 4.

MARCM utiliza el objetivo de reconocimiento de FLP sistema / (FRT) para mediar en la recombinación específica de sitio entre cromosomas homólogos en una célula precursora de separación que lleva un alelo heterocigoto de un gen represor, cuya expresión normalmente inhibe la expresión de un gen indicador 4 flipasa (FLP). Después de la división mitótica, los cromosomas recombinantes se segregan en las células individuales, de tal manera que una célula contiene alelos homocigotos del gen represor y la otra célula no tiene represor gen la expresión del reportero en esa celda (y sus descendientes) ya no es 4 bloqueado. Tres patrones clonales se encuentran generalmente en un experimento MARCM cuando FLP se induce estocásticamente en NBS o GMC: unicelulares y dos celdas-GMC clones, que representan la morfología neuronal en resolutio de una sola célulan, y multi-celular NB-clones, que revelan patrones morfológicos enteras de neuronas derivadas de un NB común (Figura 1B). La técnica MARCM se ha aplicado ampliamente en Drosophila estudios neurobiológicos, incluyendo en la identificación del tipo neuronal para la reconstrucción de las redes de cableado en todo el cerebro, los análisis de linaje neuronal para la divulgación de la historia del desarrollo de las neuronas, la caracterización fenotípica de las funciones de los genes implicados en la especificación del destino celular y morfogénesis neuronal y la diferenciación estudia 5, 6, 7, 8, 9, 10. Debido MARCM convencional sólo etiquetas una de las dos células hijas (y linajes) después del evento mitótico recombinación inducida, la información potencialmente útil desde el lado no marcado se pierde. Esta limitación impide la aplicación de la M básicoARCM sistema de análisis de alta resolución de muchos linajes neuronales que activan las células destinos en tempo rápido o para la precisión de los análisis de las funciones de genes en las neuronas idénticas de diferentes animales 11, 12.

Twin-punto MARCM (tsMARCM) es un sistema avanzado que etiqueta neuronas derivadas de un antepasado común con dos colores distintos, lo que permite la recuperación de la información útil de ambos lados de las células individuales, superando así la limitación del sistema MARCM original de 11 ( Figura 2A2C). En el sistema tsMARCM, dos interferencia de ARN (RNAi) a base de supresores están situados en trans sitios de cromosomas homólogos dentro de una célula precursora, y la expresión de los supresores de inhibir de forma independiente la expresión de sus respectivos reporteros (Figura 2B). Después de recombinación específica de sitio mediada por mitótico a través del sistema FLP / FRT, el twsupresores o basados en el ARNi se segregan en células individuales para permitir la expresión de los periodistas distintas (Figura 2 B). Dos patrones clonales, de una sola célula asociada con clones de una sola célula y de dos células-GMC asociados con clones multicelular-NB, se ven típicamente en un experimento tsMARCM (Figura 2C). La información derivada de un lado de las células individuales se puede utilizar como referencia para el otro lado, permitiendo de alta resolución análisis de linaje neural, tales como el nacimiento-data las neuronas marcadas, y análisis fenotípico de las neuronas idénticas en diferentes animales para la investigación precisa de la función génica neural 11, 12. A continuación, presentamos un protocolo paso a paso que describe cómo llevar a cabo un experimento tsMARCM, que puede ser utilizado por otros laboratorios para ampliar sus estudios sobre el desarrollo neuronal (así como el desarrollo de otros tejidos, en su caso) en Drosophila.

Protocol

1. Construir moscas tsMARCM-Ready mediante la Requerido Los transgenes 11, 13 Generar la versión original de moscas tsMARCM listas de transgenes que son transportados por las moscas individuales 11 (ver Tabla 1). Realizar esquemas estándar de moscas genéticos de cruce, que se han descrito anteriormente, poniendo múltiples transgenes en las mismas poblaciones de mosca 13. En …

Representative Results

El sistema tsMARCM se ha utilizado para facilitar linaje neural análisis y estudios de la función génica mediante la recuperación de información importante sobre las neuronas derivadas de NBS comunes. El sistema ha sido utilizado para identificar la mayoría (si no todos) los tipos neuronales, determinar el número de células de cada tipo neuronal, y determinar el orden de nacimiento de estas neuronas 11, 12, <su…

Discussion

Los pasos críticos dentro del Protocolo

Los pasos 1.1.1, 1.2.1, 2.3, 2.5 y 3.2 son fundamentales para la obtención de buenos resultados tsMARCM. Conductores Gal4 específicos de tejido que no expresan GAL4 en progenitores neurales son los preferidos para los pasos de 1.1.1 y 1.2.1. Evitar el hacinamiento de los animales criados en los viales mosca de comida en el paso 2.3. Debido a que la latencia de inducción, el nivel de expresión de FLP al choque térmico, y el tiempo medio de s…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por el Ministerio de Ciencia y Tecnología (MOST 104-2311-B-001-034) y el Instituto de Biología Celular y Organísmica, Academia Sinica, Taiwán.

Materials

Carbon dioxide (CO2) Local vendor n.a. Anesthetize flies
CO2 pad Local vendor n.a. Sort, cross and transfer flies
10x PBS pH 7.4 Uniregion Bio-Tech (or other vendors) PBS001 Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Formaldehyde Sigma-Aldrich 252549 Fix fly brains
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 Rinse, wash and immunostain fly brains
Normal goat Jackson ImmunoResearch  005-000-121 Immunostain fly brains
serum
Rat anti-mouse CD8 antibody Invitrogen MCD0800 Immunostain fly brains
Rabbit anti-DsRed antibody Clonetech 632496 Immunostain fly brains
Mouse anti-Brp antibody Developmental Studies Hybridoma Bank nc82 Immunostain fly brains
Goat anti-rat IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 488 Invitrogen A11006 Immunostain fly brains
Goat anti-rabbit IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 546 Invitrogen A11035 Immunostain fly brains
Goat anti-mouse IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 647 Invitrogen A21236 Immunostain fly brains
SlowFade gold antifade reagent Molecular Probes S36936 Mount fly brains and protect quenching of fluorescence 
PYREX 9 depression glass spot plate Corning 7220-85 Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Sylgard 184 silicone elastomer kit World Precision Instruments SYLG184 Make black Sylgard dishes to protect forceps during brain dissection
Activated charcoal Sigma-Aldrich 242276-250G Make black Sylgard dishes
Dumont #5 forceps Fine Science Tools 11252-30 Dissect and mount fly brains
Micro slide Corning 2948-75×25 Mount fly brains
Micro cover glass No.1.5 VWR International 48366-205 Mount fly brains
Nail polish Local vendor not available Seal micro cover glass on micro slides
Incubator  Kansin Instruments LTI603 culture flies at 25°C
(or other vendors)
Water bath Kansin Instruments WB212-B2 Induce heat-shock in flies at 37°C
(or other vendors)
Orbital shaker Kansin Instruments OS701 Wash and immunostain fly brains
(or other vendors)
Dissection microscope Leica EZ4 Sort, cross and transfer flies; Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Confocal microscope Zeiss (or other vendors) LSM 700 (or other models) Image tsMARCM clones
image-processing software 1
(e.g., Zeiss LSM image browser) 
Zeiss not available Project stacks of confocal images
image-processing software 2
(e.g., Image-J) 
not available not available Count cell number of tsMARCM clones

References

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Citer Cet Article
Shen, H., Hsu, T., Chung, P., Yu, H. Cell Lineage Analyses and Gene Function Studies Using Twin-spot MARCM. J. Vis. Exp. (121), e55278, doi:10.3791/55278 (2017).

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