Çift nokta MARCM kullanılması Hücre Lineage Analizleri ve Gen Fonksiyonu Çalışmaları
Summary
Burada, iki ayrı renk ortak bir progenitör hücreden türetilen nöron görselleştirme izin veren bir mozaik etiketleme tekniği için bir protokol mevcut. Bu, farklı bireylerin aynı nöronlarda doğum kalma bireysel nöronların kapasitesi ve eğitim gen fonksiyonu ile sinir soy analizi kolaylaştırır.
Abstract
M r epressible c ell m arker bir nalysis (MARCM) yaygın karmaşık morfolojileri tasvir ve aksi takdirde işaretlenmemiş ve soğukkanlı içinde nöronların alt kümelerinin genlerin işlevini işlemek için Drosophila nörobiyolojik çalışmalarda uygulanan bir pozitif mozaik etiketleme sistemi osaic organizmalardır. MARCM sisteminde üretilen genetik mozaik mitoz sırasında her iki işaretlenmiş (MARCM klonları) ve işaretlenmemiş yavru hücrelere üretilmesi için ön-madde bölünen hücreler içindeki homolog kromozomlar arasındaki yere özgü rekombinasyon yoluyla aracılık edilir. MARCM yönteminin bir uzantısıdır, adı çift Noktası MARCM (tsMARCM), iki ayrı renk ile ortak bir progenitör türetilen yataklı hücrelerin hem de etiketler. Bu teknik, hem hemi-soydan gelen yararlı bilgi alınmasını sağlamak için geliştirilmiştir. kapsamlı tsMARCM klonlarının farklı çiftleri analiz ederek, tsMARCM sistemi, yüksek çözünürlüklü sinir soy Mappin izing ortak progenitör hücrelerden üretilen etiketli nöronların tam doğum sırasını ortaya çıkarmak için. Ayrıca, tsMARCM sistemi, farklı hayvan aynı nöronların fenotipik analizi izin gen fonksiyon çalışmalarını uzanır. Burada, Drosophila nöral gelişim çalışmalarını kolaylaştırmak için tsMARCM sisteminin nasıl uygulanacağını açıklar.
Introduction
Bir çok sayıda ve nöronların farklı türde oluşan beyin, algılama, süreç ve dış dünyadan sorunlara yanıt yeteneği ile hayvanları endows. Yetişkin Drosophila merkezi beynindeki nöronlar, nöral kök hücrelerin sınırlı sayıda türetilen gelişim 1, 2 sırasında çağrılan Nöroblastlar (Onaylanmış). Onaylanmış Drosophila beyin nöron katılan çoğu kendini yenileyen Onaylanmış Kuruluşlarının ve ganglion anne hücreleri (GOK değerleri) oluşturmak için asimetrik bölünme geçmesi ve GOK değerleri daha sonra (Şekil 1A nöronlar 3 içine ayırt iki kızı hücreleri üretmek için bölünme bir tur geçmesi ). Çünkü nöronal morfoloji karışıklık ve spesifik nöronlar, pozitif bir mozaik etiketleme teknolojisi, bir bastırılabilir hücre markeri (MARCM) ile mozaik analizlerinde ile ilişkili zorluklar, visualizat sağlamak için icat edildiTek bir nöron veya çevre, etiketsiz nöronların 4 nüfusun dışında nöronların küçük bir alt iyon.
MARCM Flippase (FLP) tanımı, normal olarak, bir raportör geninin 4 ekspresyonunu önleyen bir represör genin bir heterozigot aleli taşıyan bir bölme ön-hücre içinde homolog kromozomlar arasındaki site-spesifik rekombinasyon aracılık etme / FLP tanıma hedef (STT) sistemi kullanmaktadır. mitotik bölünmesinden sonra, rekombinant kromozom artık bir hücre homozigot represör genin alelleri ve diğer hücre Resim represör genini-o hücrenin (ve onun soyundan) Raportör ekspresyonu sahip içerecek şekilde, çift hücrelere ayrılmış olan 4 engellendi. FLP stokastik Onaylanmış ve GMC'ler indüklenir sonucunda üç klonal desenler genellikle MARCM deneyde bulunan: tek hücreli çözünürlük nöronal morfoloji tasvir tek hücreli ve iki hücre GMC klonlar,ortak bir NB (Şekil 1B) türetilen nöron bütün morfolojik desenler ortaya n ve çok hücreli-NB klon. MARCM tekniği yaygın beyin çapında kablo ağlarını yeniden nöronal tip tanımlama dahil olmak üzere, Drosophila nörobiyolojik çalışmalarda uygulanmıştır, nöral soy nöronlar, hücre kaderi şartnamede yer alan gen fonksiyonlarının fenotipik karakterizasyonu gelişim tarihini ifşa analizleri ve nöronal morfonogenezi ve farklılaşma 5, 6, 7, 8, 9, 10 inceler. Geleneksel MARCM sadece uyarılmış mitoz rekombinasyon olayından sonra iki yavru hücreye (ve soy) birini etiketler, çünkü işaretsiz taraftan potansiyel olarak yararlı bilgiler kaybolur. Bu sınırlama, temel M uygulanmasını engellerYüksek çözünürlüklü ARCM sistemi hızlı tempoda hücre kaderi değiştirmek çok sinir soy analizleri veya hassas farklı hayvanların 11, 12 özdeş nöronlarda gen fonksiyonlarının analiz eder.
İkiz-spot MARCM (tsMARCM) böylece orijinal MARCM sisteminin 11 sınırlama (üstesinden ikiz hücrelerin her iki tarafın yararlı bilgi kurtarma sağlayan iki ayrı renk ile ortak bir progenitör türetilmiş nöronlar etiketleri gelişmiş bir sistemdir Şekil 2A – 2C). TsMARCM sisteminde, iki RNA interferans (RNAi) baskılayıcılar, bir ön-madde, hücre içindeki homolog kromozom trans-sitesi bulunmaktadır tabanlı ve bu baskılayıcılar ifadesi bağımsız olarak, ilgili muhabir (Şekil 2B) ekspresyonunu inhibe eder. FLP / FRT sisteminin aracılık site-spesifik rekombinasyon mitotik sonra, twhaline O RNAi tabanlı baskılayıcılar tat muhabir (Şekil 2B) ekspresyonuna izin vermek için tek kişilik hücrelere ayrılmış. İki klon desenler çok hücreli-NB klonları ile bağlantılı tek hücre klonları ve iki hücre GMC ile bağlantılı tek hücre tipik olarak bir tsMARCM deneyi (Şekil 2C) görülür. Gibi bilgiler doğum kalma etiketli nöronlar gibi nöral nesilli analiz yüksek çözünürlükte, etkinleştirme diğer taraf için referans olarak kullanılabilir çift yataklı hücrelerin bir taraftan elde edilen ve fenotipik hassas araştırma için farklı hayvan özdeş nöronların analizleri sinir gen fonksiyonu 11, 12 arasında. Burada, (varsa, yanı sıra diğer dokuların gelişimini) Drosophila nöral gelişim çalışmalarını genişletmek için diğer laboratuvarlar tarafından kullanılan bir tsMARCM deney, yapmak için nasıl açıklayan bir adım-adım protokol mevcut.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokol çerçevesinde kritik adımlar
2.5, 2.3, 1.2.1, 1.1.1 Adımlar ve 3.2 iyi tsMARCM sonuçları elde etmek için kritik öneme sahiptir. Sinir atalarda GAL4 ifade etmez, dokuya-özgü -GAL4 sürücüler adımları 1.1.1 ve 1.2.1 için tercih edilir. Adım 2.3 sinek gıda şişeleri yetiştirilen hayvanların aşırı kalabalık kaçının. Indüksiyon gecikme, ısı şoku üzerine FLP ifade seviyesi, ve sinir atalarıdır (yani, Onaylanmış ve GOK değerleri) ortalama …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Bilim ve Teknoloji Bakanlığı tarafından desteklenen (EN 104-2311-B-001-034) ve Hücresel Enstitüsü ve Organismic Biyoloji, Academia Sinica, Tayvan.
Materials
| Carbon dioxide (CO2) | Local vendor | n.a. | Anesthetize flies |
| CO2 pad | Local vendor | n.a. | Sort, cross and transfer flies |
| 10x PBS pH 7.4 | Uniregion Bio-Tech (or other vendors) | PBS001 | Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | Fix fly brains |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Rinse, wash and immunostain fly brains |
| Normal goat | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | Immunostain fly brains |
| serum | |||
| Rat anti-mouse CD8 antibody | Invitrogen | MCD0800 | Immunostain fly brains |
| Rabbit anti-DsRed antibody | Clonetech | 632496 | Immunostain fly brains |
| Mouse anti-Brp antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | nc82 | Immunostain fly brains |
| Goat anti-rat IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11006 | Immunostain fly brains |
| Goat anti-rabbit IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11035 | Immunostain fly brains |
| Goat anti-mouse IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A21236 | Immunostain fly brains |
| SlowFade gold antifade reagent | Molecular Probes | S36936 | Mount fly brains and protect quenching of fluorescence |
| PYREX 9 depression glass spot plate | Corning | 7220-85 | Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | World Precision Instruments | SYLG184 | Make black Sylgard dishes to protect forceps during brain dissection |
| Activated charcoal | Sigma-Aldrich | 242276-250G | Make black Sylgard dishes |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | Dissect and mount fly brains |
| Micro slide | Corning | 2948-75×25 | Mount fly brains |
| Micro cover glass No.1.5 | VWR International | 48366-205 | Mount fly brains |
| Nail polish | Local vendor | not available | Seal micro cover glass on micro slides |
| Incubator | Kansin Instruments | LTI603 | culture flies at 25°C |
| (or other vendors) | |||
| Water bath | Kansin Instruments | WB212-B2 | Induce heat-shock in flies at 37°C |
| (or other vendors) | |||
| Orbital shaker | Kansin Instruments | OS701 | Wash and immunostain fly brains |
| (or other vendors) | |||
| Dissection microscope | Leica | EZ4 | Sort, cross and transfer flies; Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains |
| Confocal microscope | Zeiss (or other vendors) | LSM 700 (or other models) | Image tsMARCM clones |
| image-processing software 1 (e.g., Zeiss LSM image browser) |
Zeiss | not available | Project stacks of confocal images |
| image-processing software 2 (e.g., Image-J) |
not available | not available | Count cell number of tsMARCM clones |
References
- Ito, M., Masuda, N., Shinomiya, K., Endo, K., Ito, K. Systematic analysis of neural projections reveals clonal composition of the Drosophila brain. Curr Biol. 23 (8), 644-655 (2013).
- Yu, H. H., et al. Clonal development and organization of the adult Drosophila central brain. Curr Biol. 23 (8), 633-643 (2013).
- Goodman, C. S., Doe, C. Q., Bate, M., Arias, A. M. . The Development of Drosophila melanogaster. , (1993).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
- Lee, T., Lee, A., Luo, L. Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast. Development. 126 (18), 4065-4076 (1999).
- Lee, T., Marticke, S., Sung, C., Robinow, S., Luo, L. Cell-autonomous requirement of the USP/EcR-B ecdysone receptor for mushroom body neuronal remodeling in Drosophila. Neuron. 28 (3), 807-818 (2000).
- Chiang, A. S., et al. Three-dimensional reconstruction of brain-wide wiring networks in Drosophila at single-cell resolution. Curr Biol. 21 (1), 1-11 (2011).
- Jefferis, G. S., Marin, E. C., Stocker, R. F., Luo, L. Target neuron prespecification in the olfactory map of Drosophila. Nature. 414 (6860), 204-208 (2001).
- Hong, W., Luo, L. Genetic control of wiring specificity in the fly olfactory system. Génétique. 196 (1), 17-29 (2014).
- Zhu, S., et al. Gradients of the Drosophila Chinmo BTB-zinc finger protein govern neuronal temporal identity. Cell. 127 (2), 409-422 (2006).
- Yu, H. H., Chen, C. H., Shi, L., Huang, Y., Lee, T. Twin-spot MARCM to reveal the developmental origin and identity of neurons. Nat Neurosci. 12 (7), 947-953 (2009).
- Yu, H. H., et al. A complete developmental sequence of a Drosophila neuronal lineage as revealed by twin-spot MARCM. PLoS Biol. 8 (8), (2010).
- Greenspan, R. J. . Fly pushing : the theory and practice of Drosophila genetics. , (1997).
- Awasaki, T., et al. Making Drosophila lineage-restricted drivers via patterned recombination in neuroblasts. Nat Neurosci. 17 (4), 631-637 (2014).
- Lee, T. Generating mosaics for lineage analysis in flies. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 3 (1), 69-81 (2014).
- Wu, J. S., Luo, L. A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining. Nat Protoc. 1 (4), 2110-2115 (2006).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Lin, S., Kao, C. F., Yu, H. H., Huang, Y., Lee, T. Lineage analysis of Drosophila lateral antennal lobe neurons reveals notch-dependent binary temporal fate decisions. PLoS Biol. 10 (11), e1001425 (2012).
- Zhan, X. L., et al. Analysis of Dscam diversity in regulating axon guidance in Drosophila mushroom bodies. Neuron. 43 (5), 673-686 (2004).
- Griffin, R., et al. The twin spot generator for differential Drosophila lineage analysis. Nat Methods. 6 (8), 600-602 (2009).
- Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis. Cell. 141 (3), 536-548 (2010).
- Lai, S. L., Lee, T. Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila. Nat Neurosci. 9 (5), 703-709 (2006).
- Kao, C. F., Yu, H. H., He, Y., Kao, J. C., Lee, T. Hierarchical deployment of factors regulating temporal fate in a diverse neuronal lineage of the Drosophila central brain. Neuron. 73 (4), 677-684 (2012).
