Методы исследования эпителиальной транспортной функции белков и выражение в Native кишка и Сасо-2 клеток, выращенных в 3D
Summary
Описаны простые методы для изучения регуляции кишечной функции переносчика серотонина (SERT) и выражения с использованием экстракорпорального клеточной культуры модели в ЦАС-2 клеток , выращенных в 3D и ех естественных условиях модель кишечника мыши. Эти методы применимы к изучению других эпителиальных транспортеров.
Abstract
Эпителий кишечника имеет важные транспортные и барьерные функции, которые играют ключевую роль в нормальных физиологических функций организма, обеспечивая барьер для посторонних частиц. Недостатками эпителиальной транспорт (ионов, питательных веществ, или наркотики) было связано со многими заболеваниями и может иметь последствия, которые выходят за рамки нормальных физиологических функций транспортеров, например путем оказания влияния на целостность эпителия и кишечника микробиомом. Понимание функции и регулирование транспортных белков имеет решающее значение для развития улучшенных терапевтических вмешательств. Самой большой проблемой в изучении эпителиального транспорта разрабатывает подходящую модель системы, которая резюмирует важные особенности нативных клеток эпителия кишечника. Существует несколько моделей в пробирке для культивирования клеток, такие как Сасо-2, Т-84 и НТ-29-Cl.19A клетки , как правило , используются в эпителиальной транспортных исследований. Эти клеточные линии представляют собой редукционистскую подход к моделированию еpithelium и использовались во многих механистических исследований, в том числе их изучения эпителиально-микробной взаимодействия. Однако клеточные монослои не точно отражают межклеточных взаимодействий и в естественных условиях микросреды. Клетки, выращенные в 3D показали перспективность модели для исследования проницаемости для лекарственных средств. Показано, что клетки Сасо-2 в 3D могут быть использованы для изучения эпителиальные транспортеров. Кроме того, важно, что исследования в клетках Сасо-2 дополнены другими моделями, чтобы исключить специфические клеточные эффекты и принимать во внимание сложность нативной кишечника. Существует несколько методов были ранее использованы для оценки функциональности транспортеров, таких как вывернутой мешочка и поглощение в изолированных эпителиальных клетках или в изолированных плазматических мембранных везикул. Принимая во внимание проблемы в области по отношению к моделям и измерения транспортной функции, мы демонстрируем здесь протокол для роста клеток Сасо-2 в 3D и описывают использование камеры Ussing какэффективный подход для измерения серотонина транспорта, например, в неповрежденных поляризованных кишечных эпителиев.
Introduction
Эпителий кишечника оснащен различными транспортными белками (каналы, АТФаз, со-транспортеров и теплообменников), которые выполняют множество функций, начиная от поглощения питательных веществ, электролитов и лекарственных средств к секреции жидкости и ионов в просвете. Транспортные белки генерируют электрохимические градиенты, которые позволяют перемещение ионов или молекул в векторную образом. Это достигается за счет асимметричных распределений транспортных систем в верхушечных и базолатеральных мембран поляризованных эпителиальных клеток. Кроме того, плотные соединения, которые TETHER соседние эпителиальные клетки, играют важную роль в этом процессе, выступая в качестве барьера для внутримембранных диффузии компонентов между апикальной и базолатеральной мембране доменов. Соответствующие модельные системы , имитирующие эти характерные черты родного кишечника (т.е. полярность, дифференцировку и целостность плотные контакты) имеют решающее значение для изучения Functioнальность эпителиальных транспортных систем.
Что касается моделей, типичные клеточные линии, используемые в настоящее время в кишечном эпителиальный транспортного исследования являются Сасо-2, модель полностью дифференцированной клетки, адсорбирующей способностью небольшие эпителиальные клетки кишечника; и Т84 клетки или НТ-29 субклоны, модели крипт полученных крупных эпителиальных клеток кишечника 1. Обычно, эти клеточные линии выращивают в виде монослоев в пластиковых поверхностей или в покрытых Transwell вставками. Транс-луночный культуральный вставки в некоторой степени похожи на окружающую среду в естественных условиях, позволяя поляризованные клетки кормить базолатерально. Тем не менее, ограничение в обычных системах 2D культуры является то, что клетки вынуждены адаптироваться к искусственной, плоской и жесткой поверхности. Таким образом, физиологическая сложность родного эпителии не может быть точно отражены в 2D системе. Это ограничение преодолевается с помощью методов для роста клеток в 3D в определенной микросреде, например желатиновой белка Mixturд, содержащая множество компонентов внеклеточного матрикса , 2, 3. Тем не менее, в пробирке культуры не может имитировать сложность кишечного эпителия, который имеет несколько типов клеток и региональной специфики архитектуры в кишечнике. Таким образом, исследования с использованием модели клеточной культуры требуют дальнейшей проверки в родном кишечнике. Использование в пробирке 3D культуры клеток и слизистую оболочку кишечника мыши, мы описываем здесь простые методы для изучения регуляции кишечной переносчика серотонина (SERT, SLC6A4).
СЕРТ Транспортер регулирует внеклеточный наличие важного гормона и нейромедиатора 5-гидрокситриптамина (5-НТ), путем быстрого его транспортировки через Na + / Cl – -зависимую процесс. СЕРТ является известным объектом анти-депрессантов и недавно стала новой терапевтической мишенью желудочно-кишечных расстройств, таких как диарея и воспаление кишечника.Методы для исследования поглощения 5-НТ в эпителиальных клетках кишечника были описаны ранее. Например, клетки Сасо-2 , выращенных на пластиковых опорах или проницаемых вставках было показано, обладает флуоксетин-чувствительную 3 поглощение Н-5-HT на обоих апикальной и базолатеральной доменов 4. Измерение функции SERT в изоляции Пограничные мембраны везикулы (BBMVs) , полученные из донорских органов человека тонкого кишечника также был описан нами 5. 3 поглощение Н-5-НТ в человеческих BBVMs было показано, что флуоксетин , чувствительных и Na + / Cl – -зависимая, и она выставлена скорость насыщения с K м 300 нм 5. Используя подобные методы, мы также ранее измеряли функцию SERT как 3 поглощения H-5-HT в мышиных кишечных BBMVs 6. Тем не менее, получение чистых плазматических мембран везикул требует большого количества слизистой ткани. Другие методы, такие как radiographic визуализация 3 H-5-HT сайты захвата, также было показано ранее на морских свинках и крысах тонкого кишечника 7.
Камера Ussing обеспечивает более физиологическую систему оценки переноса ионов, питательных веществ и наркотиков через различных эпителиальных тканей. Основным преимуществом метода камеры Ussing является то, что она дает возможность точного измерения электрических и транспортных параметров неповрежденной, поляризованного кишечного эпителия. Кроме того, чтобы свести к минимуму влияние внутренней нервно – мышечной системы, seromuscular стриппинг слизистой кишечника может быть выполнена , чтобы исследовать регулирование транспортеров в эпителии 8.
Показано, что Сасо-2 клетки, выращенные в 3D на желатиновой белка образуют полое просвет экспрессии различных верхушечных и базолатеральных маркеры. Эти клетки демонстрируют более высокую экспрессию SERT, чем 2D-клеток Сасо-2. Методы расти 3D клетки и реrform иммунное или РНК и белка экстракции описаны. Кроме того, мы опишем методы для изучения функции SERT и регулирование с помощью TGF- 1, плейотропных цитокина, при слизистой оболочки тонкой кишки за счет использования техники камеры Ussing.
Protocol
Representative Results
Discussion
Полностью дифференцированные монослоев Сасо-2 клеточные широко использовались в качестве поляризованный эпителиальные монослоев для изучения кишечную транспортировки 10, 11, 12, 13, 14, <sup class="xref…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Mr. Christopher Manzella, MD/PhD student in the RKG laboratory, for helping to edit and proofread our manuscript.
Materials
| 10X PBS | ATCC | ATCC® HTB37™ | Cells |
| 10X PBS | Carl Zeiss | Microsope for confocal Imaging | |
| 3[H]-5-HT | LabtekII | 152453 | Culturing cells for microscopy |
| 5-HT | Gibco | 70013-032 | Not a hazardous substance |
| 95%O2- 5%Co2 cylinder | KPL | 71-00-27 | Not a hazardous substance |
| Agar (for Agar plates) | Fischer | BP151-100 | Acute toxicity, Ora |
| Agar (for electrode) | Sigma | G7126-1KG | Not a hazardous substance |
| Alexa FluorPhalloidin | Sigma | C3867-1VL | Not a hazardous substance |
| BSA | Sigma | P6148-500G | Harmful if swallowed or if inhaled |
| CaCl2 | LifeTechnologies | A12380 | Not a hazardous substance |
| CaCo2 Cells | Sigma | A8806-5G | Not a hazardous substance |
| Cell lysis Buffer | Fischer | BP337-100 | Not a hazardous substance |
| Chabered slides | Sigma | S5886-1KG | Not a hazardous substance |
| Collagen Type-1Solution | Sigma | S8045-500G | |
| Electrodes | Sigma | S-0876 | |
| EMEM | Gibco by Life Technologies | 25200-056 | |
| Fetal bovine serum | Corning | 356234 | Used as Extracellular matrix |
| Fluoxetine | Qiagen | 74104 | |
| Gentamicin | ATCC | 30-2003 | Cell culture Media |
| Glycin | Cell Signaling, Danvers, MA | ||
| Hepes | Roche | 11836145001 | |
| Indomethacin | Gibco by Life Technologies | 15070-063 | |
| K2HPO4 | Gibco by Life Technologies | 15710-064 | |
| KOH | Gibco by Life Technologies | 15630-080 | |
| L-ascorbic acid | Gibco by Life Technologies | 10082147 | |
| Liquid scintillation counter | Gibco by Life Technologies | 70013–032 | |
| LSM710 Meta | Physiologic Instruments, San Diego, CA | EM-CSYS-8 | |
| Mannitol | Physiologic Instruments, San Diego, CA | P2304 | |
| Matrigel | Physiologic Instruments, San Diego, CA | VCC MC8 | |
| MgCl2 | Physiologic Instruments, San Diego, CA | DM MC6 | |
| Multichannel Voltage/current Clamp | Physiologic Instruments, San Diego, CA | P2300 | |
| NaCl | Physiologic Instruments, San Diego, CA | P2023-100 | |
| NaCl | Fisher Scientific, Hampton, NH | BP1423 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | S5886 | |
| Normal Goat Serum (10%) | Fisher Scientific, Hampton, NH | S233 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | P288 | |
| Pen-Strp | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | C3881 | |
| Protein assay reagent | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | 10420 | |
| Proteinase Inhibitor Cocktail | MEDOX, Chicago, IL | style G- 12300 | |
| RNA easy Mini kit | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | M4125 | |
| Single Channel Electrode Input Module | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | A92902 | |
| Sliders for snapwell Chambers | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | H9523 | |
| Sodium Phosphate (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | F132 | |
| Sodium-Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | T7039 | |
| TGF-β1 | Perkin-Elmer,Waltham, MA | NFT1167250UC | |
| TritonX-100 | Packard Instruments, Downers Grove, IL | B1600 | |
| Trypsin EDTA | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | 221473 | |
| Tween-20 | Bio Rad Laboratories, Hercules, CA | 5000006 | |
| Ussing Chamber (chamber only) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | I7378 | |
| Ussing Chamber Systems | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | A1296 |
References
- Simon-Assmann, P., Turck, N., Sidhoum-Jenny, M., Gradwohl, G., Kedinger, M. In vitro models of intestinal epithelial cell differentiation. Cell Biol Toxicol. 23 (4), 241-256 (2007).
- Shen, C., Meng, Q., Zhang, G. Design of 3D printed insert for hanging culture of Caco-2 cells. Biofabrication. 7 (1), 015003 (2014).
- Jaffe, A. B., Kaji, N., Durgan, J., Hall, A. Cdc42 controls spindle orientation to position the apical surface during epithelial morphogenesis. J Cell Biol. 183 (4), 625-633 (2008).
- Martel, F., Monteiro, R., Lemos, C. Uptake of serotonin at the apical and basolateral membranes of human intestinal epithelial (Caco-2) cells occurs through the neuronal serotonin transporter (SERT). J Pharmacol Exp Ther. 306 (1), 355-362 (2003).
- Gill, R. K., et al. Function, expression, and characterization of the serotonin transporter in the native human intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 294 (1), G254-G262 (2008).
- Esmaili, A., et al. Enteropathogenic Escherichia coli infection inhibits intestinal serotonin transporter function and expression. Gastroenterology. 137 (6), 2074-2083 (2009).
- Wade, P. R., et al. Localization and function of a 5-HT transporter in crypt epithelia of the gastrointestinal tract. J Neurosci. 16 (7), 2352-2364 (1996).
- Clarke, L. L. A guide to Ussing chamber studies of mouse intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296 (6), G1151-G1166 (2009).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Vedeler, A., Pryme, I. F., Hesketh, J. E. Insulin induces changes in the subcellular distribution of actin and 5′-nucleotidase. Mol Cell Biochem. 108 (1), 67-74 (1991).
- Botvinkin, A. D., Selimov, M. A., Zgurskaia, G. N., Kulikov, L. G., Aksenova, T. A. [Detection of rabies virus antibodies in human blood serum by an immunoenzyme method]. Vopr Virusol. 31 (3), 333-334 (1986).
- Woods, G. L., Mills, R. D. Effect of dexamethasone on detection of herpes simplex virus in clinical specimens by conventional cell culture and rapid 24-well plate centrifugation. J Clin Microbiol. 26 (6), 1233-1235 (1988).
- Chase, A. O. Acyclovir for shingles. Br Med J (Clin Res Ed. 295 (6603), 926-927 (1987).
- Churchill, P. F., Churchill, S. A., Martin, M. V., Guengerich, F. P. Characterization of a rat liver cytochrome P-450UT-H cDNA clone and comparison of mRNA levels with catalytic activity. Mol Pharmacol. 31 (2), 152-158 (1987).
- Steiner, M., Tateishi, T. Distribution and transport of calcium in human platelets. Biochim Biophys Acta. 367 (2), 232-246 (1974).
- McClelland, M., Nelson, M., Cantor, C. R. Purification of Mbo II methylase (GAAGmA) from Moraxella bovis: site specific cleavage of DNA at nine and ten base pair sequences. Nucleic Acids Res. 13 (20), 7171-7182 (1985).
- Chatterjee, I. s. h. i. t. a., K, A., Gill, R. a. v. i. n. d. e. r. . K., Alrefai, W. a. d. d. a. h. . A., Dudeja, P. r. a. d. e. e. p. . K. 3D Cell Culture of CaCo2: A Better Model to Study the Functionality and Regulation of Intestinal Ion Transporters. Gastroenterology. 146 (5, Supplement 1), S-654 (2014).
- Fagg, R. H., Hyslop, N. S. Isolation of a variant strain of foot-and-mouth disease virus (type O) during passage in partly immunized cattle. J Hyg (Lond). 64 (4), 397-404 (1966).
- Shilkina, N. P. [The aspects of the problem of systemic vasculitis open to discussion]). Ter Arkh. 61 (12), 102-106 (1989).
- Derichs, N., et al. Intestinal current measurement for diagnostic classification of patients with questionable cystic fibrosis: validation and reference data. Thorax. 65 (7), 594-599 (2010).
