طرق لدراسة النقل طلائي وظيفة البروتين والتعبير في الأمعاء الأصلية وكاتشو-2 الخلايا المزروعة في 3D
Summary
وصفنا طرق بسيطة لدراسة تنظيم نقل السيروتونين في الأمعاء وظيفة (سرت) والتعبير عن الرأي في المختبر خلية نموذج ثقافة كاتشو-2 الخلايا المزروعة في 3D ونموذج المجراة سابقا من الأمعاء الماوس. هذه الأساليب قابلة للتطبيق لدراسة النقل الظهارية الأخرى.
Abstract
ظهارة الأمعاء لها وظائف النقل وحاجز الهامة التي تلعب دورا رئيسيا في الوظائف الفسيولوجية الطبيعية للجسم في الوقت الذي توفر حاجزا أمام الجسيمات الأجنبية. ارتبط النقل الظهارية ضعف (أيون، والمواد الغذائية، أو المخدرات) مع العديد من الأمراض ويمكن أن يكون لها عواقب تتجاوز الوظائف الفسيولوجية الطبيعية للنقل، مثل من خلال التأثير على سلامة الظهارية وmicrobiome القناة الهضمية. فهم وظيفة وتنظيم البروتينات النقل هو أمر حاسم لتطوير التدخلات العلاجية تحسينها. التحدي الأكبر في دراسة النقل الظهارية بوضع نظام نموذج مناسب الذي يلخص الميزات الهامة للخلايا الظهارية في الأمعاء الأم. وتستخدم عدة نماذج زراعة الخلايا في المختبر، مثل كاتشو-2، T-84، والخلايا HT-29-Cl.19A عادة في البحوث النقل الظهارية. هذه خطوط الخلايا تمثل المقاربة الاختزالية لنمذجة هوقد استخدمت pithelium وفي العديد من الدراسات الميكانيكية، بما في ذلك فحصها من التفاعلات الظهارية الميكروبي. ومع ذلك، الطبقات الوحيدة الخلية لا تعكس بدقة التفاعلات خلية خلية والمكروية في الجسم الحي. وقد أظهرت الخلايا المزروعة في 3D لتكون واعدة نماذج لدراسات نفاذية المخدرات. وتبين لنا أن كاتشو-2 الخلايا في 3D يمكن استخدامها لدراسة النقل الظهارية. ومن المهم أيضا أن الدراسات في الخلايا كاتشو-2 وتستكمل مع نماذج أخرى لاستبعاد خلية آثار محددة وأن تأخذ في الاعتبار تعقيد الأمعاء الأصلي. وقد استخدمت عدة طرق في السابق لتقييم وظائف النقل، مثل كيس مقلوبة وامتصاص في الخلايا الظهارية المعزولة أو في عزلة حويصلات غشاء البلازما. مع الأخذ بعين الاعتبار التحديات في هذا المجال مع الاحترام لنماذج وقياس وظيفة النقل، وعلينا أن نظهر هنا بروتوكول لتنمو كاتشو-2 الخلايا في 3D ووصف استخدام لغرفة أوسينج باعتبارهانهج فعال لقياس نقل السيروتونين، كما هو الحال في الظهارة المعوية الاستقطاب سليمة.
Introduction
وقد تم تجهيز ظهارة الأمعاء مع بروتينات النقل المختلفة (القنوات، ATPases، وشارك في النقل والمبادلات) التي تؤدي وظائف عديدة بدءا من امتصاص المواد الغذائية، الشوارد، والأدوية لإفراز السوائل والأيونات في التجويف. بروتينات النقل توليد التدرجات الكهروكيميائية التي تسمح حركة الأيونات أو الجزيئات بطريقة اتجاهي. ويتحقق ذلك عن طريق توزيعات غير المتماثلة لنظم النقل في الأغشية القمية وbasolateral من الخلايا الظهارية الاستقطاب. وبالإضافة إلى ذلك، منعطفات ضيقة، الذي حبل الخلايا الظهارية المجاورة، وتلعب دورا هاما في هذه العملية بمثابة حاجز لنشر intramembrane من المكونات بين المجالات غشاء قمي وbasolateral. نظم نموذج محاكاة مناسبة هذه السمات المميزة للأمعاء الأصلي (أي القطبية، والتمايز، وسلامة تقاطع ضيقة) هي الحاسمة لدراسة functionality أنظمة النقل الظهارية.
وفيما يتعلق النماذج، وخطوط الخلايا التقليدية المستخدمة حاليا في مجال البحوث النقل الظهارية في الأمعاء هي كاتشو-2، وهذا نموذج من متباينة تماما، الاستيعابية الخلايا الظهارية في الأمعاء الصغيرة؛ والخلايا T84 أو HT-29 subclones، ونماذج من المشتقة من سرداب كبيرة الخلايا الظهارية في الأمعاء 1. تقليديا، وتزرع هذه خطوط الخلايا كما الطبقات الوحيدة في الأسطح البلاستيكية أو في إدراج transwell المغلفة. عبر أيضا إدراج ثقافة خلية إلى حد ما تشبه البيئة في الجسم الحي من خلال السماح للخلايا الاستقطاب لإطعام basolaterally. ومع ذلك، وجود قيود في نظم الاستزراع 2D التقليدية هو أن يضطر الخلايا على التكيف مع سطح الاصطناعي، شقة، وجامدة. وبالتالي، لا ينعكس تعقيد الفسيولوجية للظهائر الأم بدقة في نظام 2D. وقد تم التغلب على هذا التحديد عن طريق وسائل لزراعة خلايا في 3D في المكروية محددة، مثل mixtur البروتين هلاميةالإلكترونية، التي تحتوي على مجموعة متنوعة من المكونات المصفوفة خارج الخلية 2 و 3. ومع ذلك، يمكن للفي المختبر الثقافات ليس محاكاة تعقيد ظهارة الأمعاء، والتي لديها أنواع خلايا متعددة والهندسة المعمارية الخاصة بكل منطقة في الأمعاء. وهكذا، فإن الدراسات باستخدام نماذج ثقافة الخلية تحتاج إلى مزيد من التحقق من الصحة في الأمعاء الأصلي. باستخدام 3D الثقافة في المختبر الخلايا والأغشية المخاطية المعوية الماوس، وصفنا هنا طرق بسيطة لدراسة تنظيم نقل الأمعاء السيروتونين (SLC6A4، سرت).
ونقل سرت ينظم توافر خارج الخلية من هورمون مهم والعصبي، 5-هيدروكسي (5-HT)، قبل نقله بسرعة من خلال نا + / كلور – عملية معتمد على. سرت هو الهدف معروف عقاقير مضادة للاكتئاب وبرز مؤخرا باعتباره هدفا علاجيا جديدا لاضطرابات الجهاز الهضمي مثل الإسهال والتهاب الأمعاء.طرق للتحقيق امتصاص 5-HT في الخلايا الظهارية في الأمعاء وقد وصفت سابقا. على سبيل المثال، وقد ثبت كاتشو-2 الخلايا المزروعة على دعامات بلاستيكية أو إدراج نفاذية لعرض فلوكستين تراعي 3 H-5-HT امتصاص في كل قمي وbasolateral المجالات 4. كما تم وصف قياس وظيفة سرت في عزل فرشاة الحدود غشاء الحويصلات (BBMVs) التي أعدت من الأمعاء بالأعضاء البشرية المانحة صغيرة من قبلنا 5. تم إنذار 3 امتصاص H-5-HT في BBVMs الإنسان أن يكون فلوكستين حساسة والصوديوم + / كلور – معتمد على، وعرضت حركية التشبع مع ك م من 300 نانومتر 5. استخدام وسائل مماثلة، ونحن أيضا قياس سابقا وظيفة سرت إلى 3 امتصاص H-5-HT في الماوس BBMVs المعوية 6. ومع ذلك، فإن إعداد نقية حويصلات غشاء البلازما يتطلب كمية كبيرة من الغشاء المخاطي الأنسجة. أساليب أخرى، مثل radiogالتصور raphic من 3 مواقع امتصاص H-5-HT، وأيضا ثبت سابقا في خنزير غينيا والفئران الأمعاء الدقيقة 7.
توفر غرفة أوسينج نظام أكثر الفسيولوجية لقياس نقل الأيونات، المواد الغذائية، والمخدرات عبر مختلف الأنسجة الظهارية. والميزة الرئيسية لهذه التقنية غرفة أوسينج هو أنه تمكن من قياس دقيق للالمعلمات الكهربائية ونقل سليمة، ظهارة الأمعاء الاستقطاب. وعلاوة على ذلك، للحد من تأثير الجهاز العصبي العضلي جوهري، تجريد الطبقتين المصلية و العضلية من الغشاء المخاطي في الأمعاء يمكن القيام بها لتحقيق تنظيم النقل في الظهارة 8.
علينا أن نبرهن على كاتشو-2 الخلايا المزروعة في 3D على البروتين هلامي تشكل التجويف جوفاء تعبر عن علامات قمي وbasolateral متميزة. تظهر هذه الخلايا تعبير أعلى من سرت من 2D خلايا كاتشو-2. طرق لتنمو خلايا 3D والمؤسسة العامة لووصف rform المناعية أو RNA والبروتين الاستخراج. وبالإضافة إلى ذلك، نحن تصف أساليب لدراسة وظيفة سرت والتنظيم من قبل TGF-β1، خلوى عديد المظاهر، في الغشاء المخاطي في الأمعاء الصغيرة من خلال الاستفادة من تقنية غرفة أوسينج.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد استخدمت متباينة تماما الطبقات الوحيدة كاتشو-2 خلية على نطاق واسع كما الاستقطاب الطبقات الوحيدة الظهارية لدراسة النقل المعوي 10، 11، 12، 13، 14، 15. ومع ذلك، لمح…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Mr. Christopher Manzella, MD/PhD student in the RKG laboratory, for helping to edit and proofread our manuscript.
Materials
| 10X PBS | ATCC | ATCC® HTB37™ | Cells |
| 10X PBS | Carl Zeiss | Microsope for confocal Imaging | |
| 3[H]-5-HT | LabtekII | 152453 | Culturing cells for microscopy |
| 5-HT | Gibco | 70013-032 | Not a hazardous substance |
| 95%O2- 5%Co2 cylinder | KPL | 71-00-27 | Not a hazardous substance |
| Agar (for Agar plates) | Fischer | BP151-100 | Acute toxicity, Ora |
| Agar (for electrode) | Sigma | G7126-1KG | Not a hazardous substance |
| Alexa FluorPhalloidin | Sigma | C3867-1VL | Not a hazardous substance |
| BSA | Sigma | P6148-500G | Harmful if swallowed or if inhaled |
| CaCl2 | LifeTechnologies | A12380 | Not a hazardous substance |
| CaCo2 Cells | Sigma | A8806-5G | Not a hazardous substance |
| Cell lysis Buffer | Fischer | BP337-100 | Not a hazardous substance |
| Chabered slides | Sigma | S5886-1KG | Not a hazardous substance |
| Collagen Type-1Solution | Sigma | S8045-500G | |
| Electrodes | Sigma | S-0876 | |
| EMEM | Gibco by Life Technologies | 25200-056 | |
| Fetal bovine serum | Corning | 356234 | Used as Extracellular matrix |
| Fluoxetine | Qiagen | 74104 | |
| Gentamicin | ATCC | 30-2003 | Cell culture Media |
| Glycin | Cell Signaling, Danvers, MA | ||
| Hepes | Roche | 11836145001 | |
| Indomethacin | Gibco by Life Technologies | 15070-063 | |
| K2HPO4 | Gibco by Life Technologies | 15710-064 | |
| KOH | Gibco by Life Technologies | 15630-080 | |
| L-ascorbic acid | Gibco by Life Technologies | 10082147 | |
| Liquid scintillation counter | Gibco by Life Technologies | 70013–032 | |
| LSM710 Meta | Physiologic Instruments, San Diego, CA | EM-CSYS-8 | |
| Mannitol | Physiologic Instruments, San Diego, CA | P2304 | |
| Matrigel | Physiologic Instruments, San Diego, CA | VCC MC8 | |
| MgCl2 | Physiologic Instruments, San Diego, CA | DM MC6 | |
| Multichannel Voltage/current Clamp | Physiologic Instruments, San Diego, CA | P2300 | |
| NaCl | Physiologic Instruments, San Diego, CA | P2023-100 | |
| NaCl | Fisher Scientific, Hampton, NH | BP1423 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | S5886 | |
| Normal Goat Serum (10%) | Fisher Scientific, Hampton, NH | S233 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | P288 | |
| Pen-Strp | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | C3881 | |
| Protein assay reagent | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | 10420 | |
| Proteinase Inhibitor Cocktail | MEDOX, Chicago, IL | style G- 12300 | |
| RNA easy Mini kit | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | M4125 | |
| Single Channel Electrode Input Module | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | A92902 | |
| Sliders for snapwell Chambers | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | H9523 | |
| Sodium Phosphate (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | F132 | |
| Sodium-Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | T7039 | |
| TGF-β1 | Perkin-Elmer,Waltham, MA | NFT1167250UC | |
| TritonX-100 | Packard Instruments, Downers Grove, IL | B1600 | |
| Trypsin EDTA | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | 221473 | |
| Tween-20 | Bio Rad Laboratories, Hercules, CA | 5000006 | |
| Ussing Chamber (chamber only) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | I7378 | |
| Ussing Chamber Systems | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | A1296 |
References
- Simon-Assmann, P., Turck, N., Sidhoum-Jenny, M., Gradwohl, G., Kedinger, M. In vitro models of intestinal epithelial cell differentiation. Cell Biol Toxicol. 23 (4), 241-256 (2007).
- Shen, C., Meng, Q., Zhang, G. Design of 3D printed insert for hanging culture of Caco-2 cells. Biofabrication. 7 (1), 015003 (2014).
- Jaffe, A. B., Kaji, N., Durgan, J., Hall, A. Cdc42 controls spindle orientation to position the apical surface during epithelial morphogenesis. J Cell Biol. 183 (4), 625-633 (2008).
- Martel, F., Monteiro, R., Lemos, C. Uptake of serotonin at the apical and basolateral membranes of human intestinal epithelial (Caco-2) cells occurs through the neuronal serotonin transporter (SERT). J Pharmacol Exp Ther. 306 (1), 355-362 (2003).
- Gill, R. K., et al. Function, expression, and characterization of the serotonin transporter in the native human intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 294 (1), G254-G262 (2008).
- Esmaili, A., et al. Enteropathogenic Escherichia coli infection inhibits intestinal serotonin transporter function and expression. Gastroenterology. 137 (6), 2074-2083 (2009).
- Wade, P. R., et al. Localization and function of a 5-HT transporter in crypt epithelia of the gastrointestinal tract. J Neurosci. 16 (7), 2352-2364 (1996).
- Clarke, L. L. A guide to Ussing chamber studies of mouse intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296 (6), G1151-G1166 (2009).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Vedeler, A., Pryme, I. F., Hesketh, J. E. Insulin induces changes in the subcellular distribution of actin and 5′-nucleotidase. Mol Cell Biochem. 108 (1), 67-74 (1991).
- Botvinkin, A. D., Selimov, M. A., Zgurskaia, G. N., Kulikov, L. G., Aksenova, T. A. [Detection of rabies virus antibodies in human blood serum by an immunoenzyme method]. Vopr Virusol. 31 (3), 333-334 (1986).
- Woods, G. L., Mills, R. D. Effect of dexamethasone on detection of herpes simplex virus in clinical specimens by conventional cell culture and rapid 24-well plate centrifugation. J Clin Microbiol. 26 (6), 1233-1235 (1988).
- Chase, A. O. Acyclovir for shingles. Br Med J (Clin Res Ed. 295 (6603), 926-927 (1987).
- Churchill, P. F., Churchill, S. A., Martin, M. V., Guengerich, F. P. Characterization of a rat liver cytochrome P-450UT-H cDNA clone and comparison of mRNA levels with catalytic activity. Mol Pharmacol. 31 (2), 152-158 (1987).
- Steiner, M., Tateishi, T. Distribution and transport of calcium in human platelets. Biochim Biophys Acta. 367 (2), 232-246 (1974).
- McClelland, M., Nelson, M., Cantor, C. R. Purification of Mbo II methylase (GAAGmA) from Moraxella bovis: site specific cleavage of DNA at nine and ten base pair sequences. Nucleic Acids Res. 13 (20), 7171-7182 (1985).
- Chatterjee, I. s. h. i. t. a., K, A., Gill, R. a. v. i. n. d. e. r. . K., Alrefai, W. a. d. d. a. h. . A., Dudeja, P. r. a. d. e. e. p. . K. 3D Cell Culture of CaCo2: A Better Model to Study the Functionality and Regulation of Intestinal Ion Transporters. Gastroenterology. 146 (5, Supplement 1), S-654 (2014).
- Fagg, R. H., Hyslop, N. S. Isolation of a variant strain of foot-and-mouth disease virus (type O) during passage in partly immunized cattle. J Hyg (Lond). 64 (4), 397-404 (1966).
- Shilkina, N. P. [The aspects of the problem of systemic vasculitis open to discussion]). Ter Arkh. 61 (12), 102-106 (1989).
- Derichs, N., et al. Intestinal current measurement for diagnostic classification of patients with questionable cystic fibrosis: validation and reference data. Thorax. 65 (7), 594-599 (2010).
