Cultura di adulti transgenici Zebrafish retina espianti per live-cell imaging per Multiphoton Microscopia
Summary
la rigenerazione della retina zebrafish è stato per lo più studiata utilizzando retine fissi. Tuttavia, i processi dinamici come la migrazione nucleare interkinetic si verificano durante la risposta rigenerativa e richiedono live-cell imaging per studiare i meccanismi alla base. Qui, descriviamo condizioni di coltura e di imaging per monitorare Interkinetic migrazione nucleare (INM) in tempo reale utilizzando la microscopia multiphoton.
Abstract
Un programma di rigenerazione endogena è avviata da Müller glia nel zebrafish adulti (Danio rerio) retina seguente danno neuronale e la morte. Le Müller glia ri-entrare nel ciclo cellulare e producono cellule progenitrici neuronali che sono oggetto di ulteriori cicli di divisioni cellulari e differenziarsi in tipi di cellule neuronali persi. Sia Müller glia e cellule progenitrici neuronali nuclei replicano il loro DNA e sottoposti mitosi in posizioni distinte della retina, cioè migrano tra il basale strato interno nucleare (INL) e lo strato esterno nucleare (ONL) rispettivamente, in un processo descritto come Interkinetic La migrazione nucleare (INM). INM è stata studiata principalmente nella retina sviluppo. Per esaminare le dinamiche di INM nell'adulto rigenerante retina zebrafish in dettaglio, è necessario live-cell imaging di / cellule progenitrici neuronali fluorescenza marcata Müller glia. Qui, forniamo le condizioni per isolare e retine cultura dorsalida Tg [GFAP: nGFP] mi2004 zebrafish che sono stati esposti ad una costante luce intensa per 35 ore. Mostriamo anche che queste culture della retina sono vitali per eseguire esperimenti di imaging live-cell, acquisendo continuamente immagini z-stack per tutto lo spessore della espianto della retina per un massimo di 8 ore usando la microscopia multiphoton per monitorare il comportamento migratorio di GFAP: cellule -positive nGFP . Inoltre, si descrivono i dettagli per effettuare analisi post-imaging per determinare la velocità di INM apicale e basale. Per riassumere, abbiamo stabilito le condizioni per studiare le dinamiche di INM in un modello adulto di rigenerazione neuronale. Questo farà progredire la nostra comprensione di questo processo cellulare cruciale e ci permettono di determinare i meccanismi che controllano INM.
Introduction
A differenza di esseri umani, pesce zebra (Danio rerio) mostrano una robusta risposta la rigenerazione delle cellule alla morte dei neuroni della retina 1, 2, 3, 4. Fattore di necrosi tumorale α, una molecola di segnalazione che viene rilasciato dalla morte dei neuroni della retina induce Müller glia residente nel basale strato interno nucleare (INL) della retina, a proliferare 5 e produrre cellule progenitrici neuronali che continuano a proliferare prima differenziazione in cellule neuronali tipi morti 2, 3, 4. Durante la fase proliferativa della risposta rigenerazione, i nuclei di Müller glia e le loro cellule progenitrici neuronali derivate subiscono un modello migratorio ripetitivo in fase con il ciclo cellulare (Interkinetic migrazione nucleare, INM) 6 </sup >, 7. Nuclei posizionato nel basale INL replicare il loro DNA prima di migrare verso lo strato esterno nucleare (ONL) in cui si dividono prima i nuclei derivanti tornano basale alla INL. Questo processo è stato descritto durante lo sviluppo neuroepiteliale utilizzando metodi istologici, mentre approcci di imaging live-cell successivamente confermato l'interpretazione da Sauer 8, 9, 10, 11, 12. Entrambi gli approcci di imaging istochimiche e live-cellulari sono stati utilizzati per determinare i meccanismi sottostanti INM e la sua funzione nello sviluppo neuroepiteli compreso retina 9, 11, 12, 13. Tuttavia, i meccanismi che regolano INM nell'adulto rigenerazione della retina non sono stati studiati in molti dettaglixref "> 6, 7. live-cell imaging sarà un approccio preziosa per far progredire la nostra conoscenza delle vie di segnalazione che controllano INM nella rigenerazione della retina adulta.
Fino a poco tempo, live-cell imaging del INM nella retina era limitato a uno zebrafish embrioni vivi o pulcino embrionale o topo postnatale espianti retinici 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16. Mentre espianti di retina da animali adulti di una varietà di specie, tra cui topo, ratto e zebrafish sono stati utilizzati per la cella diversa approcci biologici 17, 18, 19, 20, esperimenti di imaging dal vivo di cellule utilizzando espianti di retina have stato limitato a brevi periodi di tempo e non sono stati eseguiti in modo continuativo per diverse ore 21, 22. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato alla cultura per adulti retine zebrafish luce danneggiato per eseguire esperimenti di imaging dal vivo di cellule monitoraggio INM utilizzando multi-fotone microscopia a 6. Approcci live-cell imaging sono vantaggiosi rispetto ai metodi di immunoistochimica nell'ambito delle indagini i meccanismi che controllano INM, come le dinamiche di INM, ad esempio, le velocità potrebbero essere interessati, piuttosto che la posizione della mitosi, che non è potenzialmente essere rilevato tramite immunocitochimica.
In futuro, questo metodo ha anche il potenziale di essere modificati per studiare altri processi dinamici durante la rigenerazione della retina, come la fagocitosi di morire fotorecettori da Müller glia o il comportamento della microglia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gli studi che indagano i meccanismi che regolano la rigenerazione dell'adulto danneggiato retina zebrafish metodi utilizzati prevalentemente immunocitochimiche 5, 25, 26, 27, 28, 29, 30. Stabilire condizioni alla cultura espianti di retina e per eseguire live-cell imaging su fenomeni, c…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Apprezziamo il sostegno fornito da William Archer e il meccanismo di Notre Dame Integrated Imaging. Un ringraziamento particolare sono dirette ai tecnici Freimann Life Sciences per il loro aiuto continuo e la loro cura e l'allevamento del pesce zebra. Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Eye Institute di NIH per DRH (R01-EY018417, R01-EY024519) e il Centro per la ricerca Zebrafish, Università di Notre Dame, Notre Dame, IN.
Materials
| Dumont forceps size #5 | World precision instruments | 14098 | |
| Dumont forceps size #5, 45° angle | World precision instruments | 14101 | |
| McPherson-Vannas scissors | World precision instruments | 501233 | |
| Fluordishes | World precision instruments | FD35-100 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ-1B | similar type of dissection stereomicroscope will work |
| Biological Safety Cabinet class type A2 | Labconco | equivalent type will work | |
| tissue culture incubator | Thermoscientific | HEPA-class 100 | equivalent type will work |
| Sylvania fluorescent lamps OSFP5835HOECO | Bulbtronics | 31850 | |
| 0.2 µm pore-size Acrodisc syringe filter | VWR | 4192 | |
| 10 ml Luer-lok syringe | VWR | BD309604 | |
| 60 ml Luer-lok syringe | VWR | BD309653 | |
| NaHCO3 | FischerScientific | S233-500 | |
| CaCl2 | ThermoScientific | C79-500 | |
| MgCl2 | EMD Millipore | 5980 | |
| HBSS w/o Ca2+/Mg2+, w/o phenol red, Gibco | ThermoScientific | 14175-095 | |
| MEM w/o phenol red, Gibco | ThermoScientific | 5100-038 | |
| Horse serum, heat-inactivated | ThermoScientific | 26050-070 | |
| penicillin/streptomycin | VWR | 16777-164 | |
| Ultrapure low melting point agarose | ThermoScientific | 16520-100 | |
| ethanol, absolute | ThermoScientific | BP2818-4 | |
| 2-phenoxyethanol | Sigma | 77699 | |
| Corning Cell-Tak cell and tissue adhesive | VWR | 354240 | |
| refractive index liquid | Cargille Lab | 1803Y | |
| Nikon A1 multiphoton microscope equipped with a MaiTai infrared laser | Nikon | equivalent system will work | |
| 40x Apo long-distance water immersion objective (N.A. 1.15) | |||
| environmental chamber equipped with insert for 35 mm petridishes | Okolab | equivalent system will work | |
| NIS analysis software | Nikon |
References
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