다중 광자 현미경으로 라이브 셀 이미징을위한 성인 형질 전환 Zebrafish의 망막의 Explants의 문화
Summary
제브라 망막 재생이 거의 고정 된 망막을 이용하여 연구되었다. 그러나, interkinetic 핵 마이그레이션 동적 프로세스는 재생 반응 중에 발생 및 기본 메커니즘을 조사하기 위해 라이브 세포 이미징을 필요로한다. 여기, 우리는 광자 현미경을 사용하여 Interkinetic 핵 마이그레이션 (INM) 실시간을 모니터링하는 문화 및 이미징 조건을 설명합니다.
Abstract
내인성 재생 프로그램은 신경 손상과 죽음 다음 (다니오 레 리오) 망막 성인 제브라 피쉬에서 뮐러 아교 세포에 의해 시작된다. 뮐러 아교 세포의 세포주기를 재 입력하고 세포 분열의 다음 라운드를 받아야하고 손실 된 신경 세포 유형으로 분화 신경 전구 세포를 생성합니다. 두 뮐러 아교 세포 및 신경 전구 세포의 핵은 DNA 복제 및 Interkinetic으로 설명한 프로세스의 망막, 즉 그들이 각각 기부 내부 핵 층 (INL) 및 (ONL)에는 외부 핵 층 사이에 이전의 별개의 위치에 유사 분열 핵 마이그레이션 (INM). INM은 주로 개발 망막에서 연구되고있다. 자세히 zebrafish의 망막을 재생 성인의 INM의 역학을 조사하기 위해 형광 표지 뮐러 아교 세포 / 신경 전구 세포의 라이브 세포 이미징이 필요합니다. 여기, 우리는 분리하는 조건 및 문화 지느러미 망막을 제공의 Tg에서 [GFAP : nGFP] 35 시간 동안 일정한 강렬한 빛에 노출 된 mi2004의 제브라 피쉬. 우리는 이러한 망막 문화가 지속적으로 GFAP의 철새 동작을 모니터링하는 광자 현미경을 사용하여 최대 8 시간 동안 망막 절편의 두께에 걸쳐 Z – 스택 이미지를 획득, 라이브 세포 이미징 실험을 수행하는 실행 가능한 것을 보여 nGFP 양성 세포를 . 또, 정점 및 기저 INM의 속도를 결정하는 사후 영상 분석을 수행하는 내용을 설명한다. 요약하면, 우리는 신경 재생의 성인 모델에서 INM의 역학을 공부하는 조건을 설립했다. 이것은이 중요한 세포 과정에 대한 우리의 이해를 발전 우리가 INM을 제어하는 메커니즘을 확인 할 수 있습니다.
Introduction
인간과 달리, 제브라 피쉬 (다니오 레 리오) 전시회 망막 뉴런 1, 2, 3, 4의 세포 사멸시 강력한 재생 응답. 종양 괴사 인자 α, 망막 신경 세포가 죽음으로부터 방출 된 시그널링 분자는 신경 세포로 분화하기 전에 증식 계속 신경 전구 세포를 5 증식 및 생산할 수있는 기저 내부 핵 층 망막 (INL)에 상주 뮐러 아교 세포를 유도 이 사망 종류 3,4-. 재생 응답의 증식기 동안 뮐러 아교 세포의 핵 및 유래 신경 전구 세포는 세포주기 (Interkinetic 핵 마이그레이션 INM) (6) 상에 반복적 이동성 패턴을 겪는다 </sup > 7. 기초 INL에 위치 핵이 발생하는 핵이 INL에 basally 반환하기 전에 그들이 나누는 외부 핵 계층 (ONL)에 이주하기 전에 자신의 DNA를 복제합니다. 라이브 세포 이미징 방식 나중에 사우어 8, 9, 10, 11, 12에 의해 해석을 확인하면서 처리는 먼저, 조직 학적 방법을 사용 neuroepithelial 개발 중에 기재 하였다. 두 조직 화학적 및 라이브 셀 촬상 접근법 INM 망막 9, 11, 12, 13을 포함 neuroepithelia 개발에 그 기능을 기본 메커니즘을 결정하는데 사용되어왔다. 그러나 망막을 재생 성인의 INM을 지배하는 메커니즘은 자세히 연구되지 않았다외부 참조 "> 6, 7. 라이브 셀 이미징은 성인 재생 망막에 INM을 제어하는 신호 전달 경로에 대한 지식을 향상 할 수있는 매우 중요한 방법이 될 것입니다.
최근까지, 망막 INM의 라이브 세포 이미징 라이브 제브라 배아 하나 또는 병아리 배아 또는 출생 후의 마우스 망막 이식편 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16에 한정되었다. 마우스, 래트 및 지브라 피쉬 포함한 다양한 종의 동물 성체의 망막 이식편은 다른 세포 생물학적 접근 17, 18, 19, 20을 위해 이용되었지만, 라이브 세포 이미징 실험 망막 하 이식편을 사용하여적이 시간의 기간을 브리핑하기 위해 제한된 몇 시간 (21, 22)를 통해 지속적으로 실행되지 않았다. 여기서 우리는 다 광자 현미경 (6)을 사용하여 라이브 세포 이미징 실험을 모니터링 INM을 수행하기 위해 문화 가벼운 손상 성인 zebrafish의 망막에 대한 상세한 프로토콜을 설명합니다. INM 역학으로, 예를 들면 속도가 오히려 잠재적 면역 세포 화학을 이용하여 검출되지 않을 분열의 위치보다 더 영향을받을 수도 INM 제어 메커니즘을 조사 할 때 라이브 셀 촬상 방법은 면역 조직 화학적 방법에 비해 유리하다.
향후,이 방법은 또한 가능성이있다하는 등의 뮐러 아교 세포 또는 미세 아교 세포의 행동에 의해 광 수용체를 죽음의 식균 작용으로 망막 재생하는 동안 다른 동적 프로세스를 연구하기 위해 수정 될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
손상된 성인 제브라 망막 주로 사용한 면역 세포 화학 방법을 5, 25, 26, 27, 28, 29, (30)의 재생을 관리하는 메커니즘을 조사 연구. 배양 망막 이식편에 조건을 설정하고, 이러한 INM 같은 현상 라이브 세포 이미징을 수행 우리 ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 윌리엄 아처와 노트르담 통합 이미징 시설에서 제공하는 지원을 주셔서 감사합니다. 특별 감사는 지속적인 도움과 자신의 관심과 제브라 피쉬의 축산에 대한 Freimann 생명 과학 기술자로 보내집니다. 본 연구는 DRH에 NIH 국립 안과 연구소 (R01-EY018417, R01-EY024519)과 Zebrafish의 연구 센터, 노트르담 대학교, 노트르담, IN에서 보조금에 의해 지원되었다.
Materials
| Dumont forceps size #5 | World precision instruments | 14098 | |
| Dumont forceps size #5, 45° angle | World precision instruments | 14101 | |
| McPherson-Vannas scissors | World precision instruments | 501233 | |
| Fluordishes | World precision instruments | FD35-100 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ-1B | similar type of dissection stereomicroscope will work |
| Biological Safety Cabinet class type A2 | Labconco | equivalent type will work | |
| tissue culture incubator | Thermoscientific | HEPA-class 100 | equivalent type will work |
| Sylvania fluorescent lamps OSFP5835HOECO | Bulbtronics | 31850 | |
| 0.2 µm pore-size Acrodisc syringe filter | VWR | 4192 | |
| 10 ml Luer-lok syringe | VWR | BD309604 | |
| 60 ml Luer-lok syringe | VWR | BD309653 | |
| NaHCO3 | FischerScientific | S233-500 | |
| CaCl2 | ThermoScientific | C79-500 | |
| MgCl2 | EMD Millipore | 5980 | |
| HBSS w/o Ca2+/Mg2+, w/o phenol red, Gibco | ThermoScientific | 14175-095 | |
| MEM w/o phenol red, Gibco | ThermoScientific | 5100-038 | |
| Horse serum, heat-inactivated | ThermoScientific | 26050-070 | |
| penicillin/streptomycin | VWR | 16777-164 | |
| Ultrapure low melting point agarose | ThermoScientific | 16520-100 | |
| ethanol, absolute | ThermoScientific | BP2818-4 | |
| 2-phenoxyethanol | Sigma | 77699 | |
| Corning Cell-Tak cell and tissue adhesive | VWR | 354240 | |
| refractive index liquid | Cargille Lab | 1803Y | |
| Nikon A1 multiphoton microscope equipped with a MaiTai infrared laser | Nikon | equivalent system will work | |
| 40x Apo long-distance water immersion objective (N.A. 1.15) | |||
| environmental chamber equipped with insert for 35 mm petridishes | Okolab | equivalent system will work | |
| NIS analysis software | Nikon |
References
- Fausett, B. V., Goldman, D. A role for alpha1 tubulin-expressing Muller glia in regeneration of the injured zebrafish retina. J.Neurosci. 26 (23), 6303-6313 (2006).
- Kassen, S. C., et al. Time course analysis of gene expression during light-induced photoreceptor cell death and regeneration in albino zebrafish. Dev.Neurobiol. 67 (8), 1009-1031 (2007).
- Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina. J.Neurobiol. 44 (3), 289-307 (2000).
- Bernardos, R. L., Barthel, L. K., Meyers, J. R., Raymond, P. A. Late-stage neuronal progenitors in the retina are radial Muller glia that function as retinal stem cells. J.Neurosci. 27 (26), 7028-7040 (2007).
- Nelson, C. M., Ackerman, K. M., O’Hayer, P., Bailey, T. J., Gorsuch, R. A., Hyde, D. R. Tumor necrosis factor-alpha is produced by dying retinal neurons and is required for Muller glia proliferation during zebrafish retinal regeneration. J.Neurosci. 33 (15), 6524-6539 (2013).
- Lahne, M., Li, J., Marton, R. M., Hyde, D. R. Actin-Cytoskeleton- and Rock-Mediated INM Are Required for Photoreceptor Regeneration in the Adult Zebrafish Retina. J.Neurosci. 35 (47), 15612-15634 (2015).
- Nagashima, M., Barthel, L. K., Raymond, P. A. A self-renewing division of zebrafish Muller glial cells generates neuronal progenitors that require N-cadherin to regenerate retinal neurons. Development. 140 (22), 4510-4521 (2013).
- Sauer, M. E., Walker, B. E. Radioautographic study of interkinetic nuclear migration in the neural tube. Proc.Soc.Exp.Biol.Med. 101 (3), 557-560 (1959).
- Pearson, R. A., Luneborg, N. L., Becker, D. L., Mobbs, P. Gap junctions modulate interkinetic nuclear movement in retinal progenitor cells. J.Neurosci. 25 (46), 10803-10814 (2005).
- Baye, L. M., Link, B. A. Interkinetic nuclear migration and the selection of neurogenic cell divisions during vertebrate retinogenesis. J.Neurosci. 27 (38), 10143-10152 (2007).
- Del Bene, F., Wehman, A. M., Link, B. A., Baier, H. Regulation of neurogenesis by interkinetic nuclear migration through an apical-basal notch gradient. Cell. 134 (6), 1055-1065 (2008).
- Norden, C., Young, S., Link, B. A., Harris, W. A. Actomyosin is the main driver of interkinetic nuclear migration in the retina. Cell. 138 (6), 1195-1208 (2009).
- Becker, D. L., et al. Multiphoton imaging of chick retinal development in relation to gap junctional communication. J.Physiol. 585 (Pt 3), 711-719 (2007).
- Surzenko, N., Crowl, T., Bachleda, A., Langer, L., Pevny, L. SOX2 maintains the quiescent progenitor cell state of postnatal retinal Muller glia. Development. 140 (7), 1445-1456 (2013).
- Nickerson, P. E., et al. Live imaging and analysis of postnatal mouse retinal development. BMC Dev.Biol. 13, 24 (2013).
- Suzuki, S. C., Bleckert, A., Williams, P. R., Takechi, M., Kawamura, S., Wong, R. O. Cone photoreceptor types in zebrafish are generated by symmetric terminal divisions of dedicated precursors. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 110 (37), 15109-15114 (2013).
- Johnson, T. V., Martin, K. R. Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model. Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 49 (8), 3503-3512 (2008).
- Bull, N. D., Johnson, T. V., Welsapar, G., DeKorver, N. W., Tomarev, S. I., Martin, K. R. Use of an adult rat retinal explant model for screening of potential retinal ganglion cell neuroprotective therapies. Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 52 (6), 3309-3320 (2011).
- Kustermann, S., Schmid, S., Biehlmaier, O., Kohler, K. Survival, excitability, and transfection of retinal neurons in an organotypic culture of mature zebrafish retina. Cell Tissue Res. 332 (2), 195-209 (2008).
- Williams, P. R., Morgan, J. L., Kerschensteiner, D., Wong, R. O. In vitro imaging of retinal whole mounts. Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).
- Johnson, T. V., Oglesby, E. N., Steinhart, M. R., Cone-Kimball, E., Jefferys, J., Quigley, H. A. Time-Lapse Retinal Ganglion Cell Dendritic Field Degeneration Imaged in Organotypic Retinal Explant Culture. Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 57 (1), 253-264 (2016).
- Roehlecke, C., Schumann, U., Ader, M., Knels, L., Funk, R. H. Influence of blue light on photoreceptors in a live retinal explant system. Mol.Vis. 17, 876-884 (2011).
- Coutu, D. L., Schroeder, T. Probing cellular processes by long-term live imaging–historic problems and current solutions. J.Cell.Sci. 126 (Pt 17), 3805-3815 (2013).
- Thomas, J. L., Thummel, R. A novel light damage paradigm for use in retinal regeneration studies in adult zebrafish. J.Vis.Exp. 80, e51017 (2013).
- Conner, C., Ackerman, K. M., Lahne, M., Hobgood, J. S., Hyde, D. R. Repressing notch signaling and expressing TNFalpha are sufficient to mimic retinal regeneration by inducing Muller glial proliferation to generate committed progenitor cells. J.Neurosci. 34 (43), 14403-14419 (2014).
- Nelson, C. M., Gorsuch, R. A., Bailey, T. J., Ackerman, K. M., Kassen, S. C., Hyde, D. R. Stat3 defines three populations of Muller glia and is required for initiating maximal muller glia proliferation in the regenerating zebrafish retina. J.Comp.Neurol. 520 (18), 4294-4311 (2012).
- Gorsuch, R. A., Hyde, D. R. Regulation of Muller glial dependent neuronal regeneration in the damaged adult zebrafish retina. Exp.Eye Res. 123, 131-140 (2014).
- Zhao, X. F., Wan, J., Powell, C., Ramachandran, R., Myers, M. G., Goldman, D. Leptin and IL-6 family cytokines synergize to stimulate Muller glia reprogramming and retina regeneration. Cell.Rep. 9 (1), 272-284 (2014).
- Wan, J., Ramachandran, R., Goldman, D. HB-EGF is necessary and sufficient for Muller glia dedifferentiation and retina regeneration. Dev.Cell. 22 (2), 334-347 (2012).
- Lenkowski, J. R., et al. Retinal regeneration in adult zebrafish requires regulation of TGFbeta signaling. Glia. 61 (10), 1687-1697 (2013).
- Weber, I. P., Ramos, A. P., Strzyz, P. J., Leung, L. C., Young, S., Norden, C. Mitotic position and morphology of committed precursor cells in the zebrafish retina adapt to architectural changes upon tissue maturation. Cell.Rep. 7 (2), 386-397 (2014).
- Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing photodamage in live-cell microscopy. Methods Cell Biol. 114, 545-560 (2013).
- Bailey, T. J., Fossum, S. L., Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. The inhibitor of phagocytosis, O-phospho-L-serine, suppresses Muller glia proliferation and cone cell regeneration in the light-damaged zebrafish retina. Exp.Eye Res. 91 (5), 601-612 (2010).
- Lee, J. E., Liang, K. J., Fariss, R. N., Wong, W. T. Ex vivo dynamic imaging of retinal microglia using time-lapse confocal microscopy. Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 49 (9), 4169-4176 (2008).
- Zhao, L., et al. Microglial phagocytosis of living photoreceptors contributes to inherited retinal degeneration. EMBO Mol.Med. 7 (9), 1179-1197 (2015).
- Peri, F., Nusslein-Volhard, C. Live imaging of neuronal degradation by microglia reveals a role for v0-ATPase a1 in phagosomal fusion in vivo. Cell. 133 (5), 916-927 (2008).
- Morsch, M., et al. In vivo characterization of microglial engulfment of dying neurons in the zebrafish spinal cord. Front.Cell.Neurosci. 9, 321 (2015).
