Cultura de adulto pez cebra transgénico de retina explantes de Células vivas imágenes de microscopía multifotónica
Summary
la regeneración de la retina del pez cebra en su mayoría se ha estudiado el uso de las retinas fijos. Sin embargo, los procesos dinámicos tales como la migración nuclear interkinetic se producen durante la respuesta regenerativa y requieren imágenes de células vivas para investigar los mecanismos subyacentes. A continuación, describimos las condiciones de cultivo y de imagen para controlar interkinetic Migración Nuclear (INM) en tiempo real usando microscopía multifotónica.
Abstract
Un programa de regeneración endógena es iniciada por las células de Müller en el pez cebra adulto (Danio rerio) retina después del daño neuronal y la muerte. Las células de Müller volver a entrar en el ciclo celular y producen células progenitoras neuronales que se someten a las siguientes rondas de división celular y se diferencian en los tipos de células neuronales perdidos. Tanto las células de Müller y de células progenitoras neuronal núcleos replican su DNA y se someten a la mitosis en lugares distintos de la retina, es decir, que migran entre el basal capa interior Nuclear (INL) y la capa exterior Nuclear (ONL), respectivamente, en un proceso descrito como interkinetic La migración nuclear (INM). INM predominantemente se ha estudiado en la retina en desarrollo. Para examinar la dinámica del INM en el adulto regeneración de la retina del pez cebra en detalle, se requiere imágenes de células vivas de las células marcadas con fluorescencia las células de Müller / progenitoras neuronales. Aquí, proporcionamos las condiciones para aislar y retinas cultura dorsalesde Tg [GFA: nGFP] pez cebra mi2004 que fueron expuestos a una luz intensa constante durante 35 h. También se muestra que estos cultivos de retina son viables para llevar a cabo experimentos de imágenes de células vivas, la adquisición de imágenes de forma continua z-stack en todo el espesor de la retina explante para un máximo de 8 h utilizando microscopía multifotónica para monitorear el comportamiento migratorio de GFA: células positivas nGFP . Además, se describen los detalles para realizar el análisis posterior a la proyección de imagen para determinar la velocidad del INM apical y basal. En resumen, hemos establecido las condiciones para estudiar la dinámica del INM en un modelo adulto de la regeneración neuronal. Esto hará avanzar nuestra comprensión de este proceso celular crucial y nos permitirá determinar los mecanismos que controlan el INM.
Introduction
A diferencia de los seres humanos, el pez cebra (Danio rerio) exhiben una robusta respuesta de regeneración después de la muerte celular de neuronas de la retina 1, 2, 3, 4. Factor de necrosis tumoral α, una molécula de señalización que se libera de la muerte las neuronas de la retina induce las células de Müller residente en el basal capa interior Nuclear (INL) de la retina, a proliferar 5 y producir células progenitoras neuronales que siguen proliferando antes de la diferenciación en la célula neuronal tipos que murieron 2, 3, 4. Durante la fase proliferativa de la respuesta de la regeneración, los núcleos de las células de Müller y sus células progenitoras neuronales derivadas se someten a un patrón migratorio repetitivo en fase con el ciclo celular (interkinetic migración Nuclear, INM) 6 </sup > 7. Los núcleos posicionado en la INL basal replicar su ADN antes de migrar a la capa exterior Nuclear (ONL) donde se dividen antes de que surjan los núcleos vuelven basalmente a la INL. Este proceso fue descrito por primera vez durante el desarrollo neuroepitelial utilizando métodos histológicos, mientras que los enfoques de formación de imágenes de células vivas después confirmaron la interpretación por Sauer 8, 9, 10, 11, 12. Ambos enfoques de imagen histoquímicos y de células vivas se han utilizado para determinar los mecanismos INM y su función en el desarrollo de la retina incluyendo neuroepithelia 9, 11, 12, 13 subyacentes. Sin embargo, los mecanismos que regulan INM en el adulto regeneración de retina no han sido estudiados en mayor detallexref "> 6, 7. Células vivas imágenes será una forma muy valiosa para avanzar en el conocimiento de las vías de señalización que controlan el INM en la retina adulta regeneración.
Hasta hace poco tiempo, imágenes de células vivas del INM en la retina se limita a cualquiera de embriones de pez cebra en vivo o embriones de pollo o postnatal ratón explantes de retina 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16. Mientras que los explantes de retina de animales adultos de una variedad de especies, incluyendo ratones, ratas y pez cebra han sido utilizados para diferentes enfoques biológicos celular 17, 18, 19, 20, experimentos de imágenes de células vivas utilizando explantes de retina jahan estado restringidos a breves períodos de tiempo y no han sido ejecutados de forma continua durante varias horas 21, 22. A continuación, describimos un protocolo detallado para la cultura retinas de pez cebra adultos de luz dañadas para llevar a cabo experimentos de imágenes de células vivas monitoreo INM usando microscopía multifotónica 6. Enfoques imágenes de células vivas son ventajosas respecto a los métodos inmunohistoquímicos en la investigación de los mecanismos que controlan el INM, como la dinámica del INM, por ejemplo, las velocidades pueden verse afectados en lugar de la ubicación de la mitosis, lo que potencialmente no ser detectado mediante inmunocitoquímica.
En el futuro, este método tiene también el potencial de ser modificado para estudiar otros procesos dinámicos durante la regeneración de la retina, tales como fagocitosis de morir fotorreceptores por las células de Müller o el comportamiento de microglia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los estudios que investigan los mecanismos que regulan la regeneración de la retina del pez cebra adulto dañado fundamentalmente métodos usados inmuno 5, 25, 26, 27, 28, 29, 30. El establecimiento de las condiciones de cultivo de explantes de retina a y para realizar imágenes de célula…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos el apoyo proporcionado por William Archer y el Servicio Integrado de Notre Dame de imagen. Gracias especiales se dirigen a los técnicos Freimann Ciencias de la Vida por su continua ayuda y su cuidado y la cría del pez cebra. Este estudio fue apoyado por subvenciones del Instituto Nacional del Ojo de los NIH para DRH (R01-EY018417, R01-EY024519) y el Centro de Investigación de pez cebra, Universidad de Notre Dame, Notre Dame, IN.
Materials
| Dumont forceps size #5 | World precision instruments | 14098 | |
| Dumont forceps size #5, 45° angle | World precision instruments | 14101 | |
| McPherson-Vannas scissors | World precision instruments | 501233 | |
| Fluordishes | World precision instruments | FD35-100 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ-1B | similar type of dissection stereomicroscope will work |
| Biological Safety Cabinet class type A2 | Labconco | equivalent type will work | |
| tissue culture incubator | Thermoscientific | HEPA-class 100 | equivalent type will work |
| Sylvania fluorescent lamps OSFP5835HOECO | Bulbtronics | 31850 | |
| 0.2 µm pore-size Acrodisc syringe filter | VWR | 4192 | |
| 10 ml Luer-lok syringe | VWR | BD309604 | |
| 60 ml Luer-lok syringe | VWR | BD309653 | |
| NaHCO3 | FischerScientific | S233-500 | |
| CaCl2 | ThermoScientific | C79-500 | |
| MgCl2 | EMD Millipore | 5980 | |
| HBSS w/o Ca2+/Mg2+, w/o phenol red, Gibco | ThermoScientific | 14175-095 | |
| MEM w/o phenol red, Gibco | ThermoScientific | 5100-038 | |
| Horse serum, heat-inactivated | ThermoScientific | 26050-070 | |
| penicillin/streptomycin | VWR | 16777-164 | |
| Ultrapure low melting point agarose | ThermoScientific | 16520-100 | |
| ethanol, absolute | ThermoScientific | BP2818-4 | |
| 2-phenoxyethanol | Sigma | 77699 | |
| Corning Cell-Tak cell and tissue adhesive | VWR | 354240 | |
| refractive index liquid | Cargille Lab | 1803Y | |
| Nikon A1 multiphoton microscope equipped with a MaiTai infrared laser | Nikon | equivalent system will work | |
| 40x Apo long-distance water immersion objective (N.A. 1.15) | |||
| environmental chamber equipped with insert for 35 mm petridishes | Okolab | equivalent system will work | |
| NIS analysis software | Nikon |
References
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