Kultur av vuxna Transgena Zebrafish retinal explants för Live-cell imaging av multifotonMicrosCopy

Summary

Zebrafisk retinal förnyelse har mestadels studerats med hjälp av fasta näthinnor. Men dynamiska processer såsom interkinetic kärn migration inträffar under den regenerativa svar och kräver levande cell imaging att undersöka de bakomliggande mekanismerna. Här beskriver vi kultur och avbildningsbetingelser för att övervaka Interkinetic Nuclear Migration (INM) i realtid med hjälp av multifotonmikroskop.

Abstract

En endogen förnyelseprogram initieras av Müller glia i den vuxna zebrafisk (Danio rerio) näthinnan efter nervskada och dödsfall. Muller Glia tillbaka in i cellcykeln och producera neuronala progenitorceller som genomgår efterföljande omgångar av celldelning och differentierar till de förlorade neuronala celltyper. Både Müller Glia och neuronal progenitor cellkärnor replikera sitt DNA och genomgår mitos i distinkta platser i näthinnan, dvs de migrerar mellan de basala Inre Kärn- Layer (INL) och yttre kärnlagret (ONL), respektive, i en process som beskrivs som Interkinetic Nuclear Migration (INM). INM har främst studerats i utvecklings näthinnan. För att undersöka dynamiken i INM i vuxen regenererande zebrafisk näthinnan i detalj krävs levande cell imaging av fluorescensmärkta Müller glia / neuronala stamceller. Här ger vi förutsättningar för att isolera och kultur rygg näthinnorfrån Tg [GFAP: nGFP] ^mi2004 zebrafisk som utsattes för konstant intensivt ljus för 35 h. Vi visar också att dessa retinala kulturer är lönsamt att utföra levande cell imaging experiment kontinuerligt förvärva z-stack bilder hela tjockleken av näthinnans Explantation för upp till 8 h med multifotonmikroskop att övervaka migrations beteende GFAP: nGFP -positiva celler . Dessutom beskriver vi detaljerna att utföra efter bildanalys för att bestämma hastigheten för apikala och basala INM. Sammanfattningsvis har vi etablerat förutsättningar för att studera dynamiken i INM i en vuxen modell av neuronal regeneration. Detta kommer att öka vår förståelse av denna viktiga cellulär process och ger oss möjlighet att bestämma de mekanismer som styr INM.

Introduction

Till skillnad från människor, zebrafisk (Danio rerio) uppvisar en robust regeneresvar vid celldöd av retinala neuroner ^{1, 2, 3, 4.} Tumörnekrosfaktor α, en signalerande molekyl som frisätts från döende retinala neuroner inducerar Muller Glia bosatt i basal Inre Kärn- Layer (INL) av näthinnan, att proliferera ⁵ och producera neuronala progenitorceller som fortsätter att föröka sig före differentiera till den neuronala cellen typer som dog ^{2, 3, 4.} Under den proliferativa fasen av förnyelse svar kärnorna av Müller glia och deras härledda neuronala stamceller genomgå en repetitiv migrationsmönster i fas med cellcykeln (Interkinetic Nuclear Migration, INM) ⁶ </sup ^{>, 7.} Kärnor placeras i de basala INL replikera sitt DNA innan den vandrar till yttre kärnlagret (ENDA) där de delar innan de uppstår kärnorna återgår basalt till INL. Denna process beskrevs först under neuroepiteliala utveckling med histologiska metoder, medan levande celler avbildning senare bekräftade tolkningen av Sauer ^{8, 9, 10, 11, 12.} Både histokemiska och live-cell imaging metoder har använts för att bestämma mekanismerna bakom INM och dess funktion i att utveckla neuroepithelia inklusive näthinnan ^{9, 11, 12, 13.} Däremot har de mekanismer som styr INM i vuxen regenere näthinnan inte studerats i stor detaljxref "> ^{6, 7.} Live-cell imaging kommer att vara en ovärderlig metod för att förbättra vår kunskap om de signalvägar som styr INM i vuxen regenere näthinnan.

Tills nyligen var levande cell imaging av INM i näthinnan begränsad till antingen levande zebrafisk embryon eller embryonala chick eller postnatal mus näthinnan explants ^{9, 10, 11, 12, 14, 15, 16.} Medan näthinnan explants från vuxna djur av en mängd olika arter, inklusive mus, råtta och zebrafisk har använts för olika cellbiologiska metoder ^{17, 18, 19, 20,} imaging levande cell experiment med användning av retinala explants have varit begränsad till korta tidsperioder och har inte utförts kontinuerligt under flera timmar ^{21, 22.} Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för att odla ljus skadade vuxna zebrafisk näthinnor att utföra levande cell imaging experiment övervakning INM med hjälp av multi-foton mikroskopi ^6. Live-cell imaging metoder är fördelaktiga över immunhistokemiska metoder när man undersöker de mekanismer som styr INM, eftersom dynamiken i INM, till exempel, hastigheter kan påverkas snarare än placeringen av mitos, som eventuellt inte kan upptäckas med hjälp av immuncytokemi.

I framtiden, har denna metod också potential att ändras för att studera andra dynamiska processer under retinal förnyelse, såsom fagocytos att dö fotoreceptorer från Müller glia eller beteende mikroglia.

Protocol

Obs: Zebrafish höjdes och underhållas i Notre Dame Zebrafish anläggning i Freimann Life Sciences Center. De metoder som beskrivs i detta manuskript är godkända av University of Notre Dame Animal Care och användning kommittén och är i överensstämmelse med uttalandet för användning av djur i en syn forskning av Föreningen för forskning i Vision och Ophthalmology. 1. Lösningar Förbered 70% etanol för att sterilisera vävnadsodling huva och all utrustning / reagenser …

Representative Results

Isoleringen av näthinnan i enlighet med förfarandet som skisseras i den schematiska i fig 1 medger odling av en tillplattad dorsal näthinna från ljus-skadade vuxna Tg [GFAP: nGFP] mi2004 zebrafisk under en period av minst 24 timmar i en 5% CO 2 / luftmiljö. Dessa platt-monterade retinala explants kan användas för att avbilda fokalplan på djupa vävnadsnivåer. Ett exempel är Müller Glia / neuronala stamfadercellkärnor märkta med…

Discussion

Studier som undersöker de mekanismer som styr regenerering av skadade vuxna zebrafisk näthinnan främst används immunocytokemiska metoder ^{5, 25, 26, 27, 28, 29, 30.} Skapa förutsättningar för kultur retinala explants och utföra levande cell imaging på företeelser, såsom INM, ger os…

Materials

Dumont forceps size #5	World precision instruments	14098
Dumont forceps size #5, 45° angle	World precision instruments	14101
McPherson-Vannas scissors	World precision instruments	501233
Fluordishes	World precision instruments	FD35-100
Stereomicroscope	Nikon	SMZ-1B	similar type of dissection stereomicroscope will work
Biological Safety Cabinet class type A2	Labconco		equivalent type will work
tissue culture incubator	Thermoscientific	HEPA-class 100	equivalent type will work
Sylvania fluorescent lamps OSFP5835HOECO	Bulbtronics	31850
0.2 µm pore-size Acrodisc syringe filter	VWR	4192
10 ml Luer-lok syringe	VWR	BD309604
60 ml Luer-lok syringe	VWR	BD309653
NaHCO3	FischerScientific	S233-500
CaCl2	ThermoScientific	C79-500
MgCl2	EMD Millipore	5980
HBSS w/o Ca2+/Mg2+, w/o phenol red, Gibco	ThermoScientific	14175-095
MEM w/o phenol red, Gibco	ThermoScientific	5100-038
Horse serum, heat-inactivated	ThermoScientific	26050-070
penicillin/streptomycin	VWR	16777-164
Ultrapure low melting point agarose	ThermoScientific	16520-100
ethanol, absolute	ThermoScientific	BP2818-4
2-phenoxyethanol	Sigma	77699
Corning Cell-Tak cell and tissue adhesive	VWR	354240
refractive index liquid	Cargille Lab	1803Y
Nikon A1 multiphoton microscope equipped with a MaiTai infrared laser	Nikon		equivalent system will work
40x Apo long-distance water immersion objective (N.A. 1.15)
environmental chamber equipped with insert for 35 mm petridishes	Okolab		equivalent system will work
NIS analysis software	Nikon