Multiphoton Mikroskopi Canlı hücre Görüntüleme için Yetişkin Transgenik Zebra balığı Retina Eksplantlarından Kültür
Summary
Zebra balığı retina rejenerasyon çoğunlukla sabit retina kullanılarak incelenmiştir. Ancak, bu tür interkinetic nükleer göç gibi dinamik süreçler rejeneratif tepki sırasında meydana gelen ve altında yatan mekanizmaları araştırmak için canlı hücre görüntüleme gerektirir. Burada, biz multiphoton mikroskopi kullanılarak Interkinetic Nükleer Göç (INM) gerçek zamanlı olarak izlemek için kültür ve görüntüleme koşulları açıklar.
Abstract
Bir endojen rejenerasyon programı nöronal hasar ve ölümünden sonra (Danio rerio) retina yetişkin zebrafish Müller glia tarafından başlatılır. Müller glia hücre döngüsünü tekrar girin ve hücre bölünmeleri daha sonraki mermi geçmesi ve kayıp nöronal hücre tiplerine ayırt nöronal progenitör hücreler üretmek. Hem Müller glia ve nöronal progenitör hücre çekirdekleri kendi DNA'sını çoğaltmak ve Interkinetic olarak tanımlanan bir süreç içinde retinanın, yani sırasıyla, bazal İç Nükleer Katmanı (INL) ve (onl) Dış Nükleer Katman arasında göç ayrı yerlerde mitoz geçiren nükleer Göç (INM). INM ağırlıklı gelişmekte olan retinada incelenmiştir. detaylı Zebra balığı retina rejenere erişkin INM dinamiklerini incelemek için, floresan etiketli Müller glia / nöronal progenitör hücrelerin canlı hücre görüntüleme gereklidir. Burada, biz izole etmek için koşullar ve kültür dorsal retina sağlamakTg dan [GFAP: nGFP] 35 saat süreyle sürekli yoğun ışığa maruz bırakıldı mi2004 zebra balığı. Biz de bu retina kültürleri sürekli olarak GFAP göç davranışlarını izlemek için multiphoton mikroskopi kullanılarak en fazla 8 saat retina eksplant kalınlığı boyunca z-yığın görüntüleri elde, canlı hücre görüntüleme deneyleri gerçekleştirmek için geçerli olduğunu göstermektedir: nGFP pozitif hücreler . Ayrıca, apikal ve bazal INM hızını belirlemek için post-görüntüleme analizi gerçekleştirmek ayrıntıları açıklar. Özetlemek gerekirse, biz nöronal rejenerasyon bir yetişkin modelinde INM dinamiklerini incelemek için koşulları oluşturmuştur. Bu, bu çok önemli hücresel sürecin anlayışımızı ilerletmek ve bize INM kontrol mekanizmaları belirlemek için izin verecektir.
Introduction
Insanlarda farklı olarak, zebra balığı (Danio rerio) sergiler retina nöronlarının, 1, 2, 3, 4, hücre ölümü üzerine sağlam bir rejenerasyon yanıt. Tümör nekroz faktörü α, retina nöronlarının ölen salınan bir sinyal molekülü nöronal hücre ayırma yöntemi önce çoğalmaya devam nöronal progenitör hücreler 5 çoğalır ve üretilmesi için taban iç nükleer tabaka retinanın (INL) ikamet Müller glia indüklemektedir 2 ölen türleri, 3, 4. Yenilenmesi tepkisinin çoğalma fazı sırasında, Müller glia çekirdekleri ve elde edilen nöronal progenitör hücreler, hücre siklüsü (Interkinetic Nükleer Göç, INM) 6 aşamasında tekrar eden göç desen geçmesi </sup > 7. bazal INL konumlandırılmış Çekirdekler çıkan çekirdekleri INL için dorsalde dönmeden önce onlar bölmek Dış Nükleer Layer (onl) göç önce DNA çoğaltırlar. Canlı hücre görüntüleme teknikleri, daha sonra Sauer 8, 9, 10, 11, 12 ile bir yorum teyit Bu süreç ilk olarak, histolojik yöntemlerle nöroepitelyal gelişimi sırasında açıklanmıştır. Hem histokimyasal ve canlı hücre görüntüleme yaklaşımları İNM ve retina 9, 11, 12, 13 olmak üzere neuroepithelia gelişmekte işlevini altında yatan mekanizmaları belirlemek için kullanılmıştır. Ancak, retina yenileyici yetişkin İNM yöneten mekanizmalar çok ayrıntılı olarak araştırılmamıştırxref "> 6, 7. Canlı hücre görüntüleme yetişkin yenileyici retina İNM kontrol sinyal yollarının bilgimizi ilerletmek için paha biçilmez bir yaklaşım olacaktır.
Yakın zamana kadar, retina INM canlı hücre görüntüleme canlı zebra balığı embriyolar ya ya da piliç embriyonik veya postnatal fare retinal eksplantlar 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16 ile sınırlı kalmıştır. Fare, sıçan ve zebrabalıkları içeren türlerin çeşitli yetişkin hayvanların retina eksplantlar, farklı hücre biyolojik yaklaşımlar 17, 18, 19, 20 için kullanılmış olmakla birlikte, canlı hücre görüntüleme deneyleri retina eksplantlar ha kullanılarakziyaretinde sürelerde bilgilendirmek kısıtlandı ve birkaç saat 21, 22 üzerinde sürekli olarak gerçekleştirilir edilmemiştir. Burada, çoklu foton mikroskopi 6 kullanarak canlı hücre görüntüleme deneyleri izleme İNM gerçekleştirmek için kültür ışık hasarlı yetişkin zebrabalıkları retina için ayrıntılı bir protokol açıklar. INM dinamikleri olarak, örneğin, hızlar oldukça potansiyel immünsitokimya kullanılarak tespit olmaz mitoz konumu, daha etkilenebilir, INM kontrol mekanizmaları araştırılırken Canlı hücre görüntüleme yaklaşımları immünohistokimyasal yöntemlere göre avantajlıdır.
Gelecekte, bu yöntem aynı zamanda bir potansiyele sahip gibi Müller glia ya da mikroglia davranışları ile fotoreseptör ölme fagositoz gibi retinal rejenerasyon sırasında diğer dinamik süreçleri incelemek için modifiye edilmesi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hasarlı yetişkin Zebra balığı retinanın ağırlıklı kullanılan immünositokimyasal yöntemler 5, 25, 26, 27, 28, 29, 30 yenilenmesini düzenleyen mekanizmaları araştıran çalışmalar. kültür retina eksplantlar koşulları oluşturulması ve bu tür INM olarak fenomenler, canl…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
William Archer ve Notre Dame Entegre Görüntüleme Tesisi tarafından sağlanan destek için teşekkür ederiz. Özel teşekkür onların sürekli yardım ve onların bakım ve zebrafish hayvancılık için Freimann Yaşam Bilimleri teknisyenleri yönlendirilir. Bu çalışma DRH için NIH Ulusal Göz Enstitüsü (R01-EY018417, R01-EY024519) ve Zebra balığı Araştırma Merkezi, Notre Dame Üniversitesi, Notre Dame, IN hibe ile desteklenmiştir.
Materials
| Dumont forceps size #5 | World precision instruments | 14098 | |
| Dumont forceps size #5, 45° angle | World precision instruments | 14101 | |
| McPherson-Vannas scissors | World precision instruments | 501233 | |
| Fluordishes | World precision instruments | FD35-100 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ-1B | similar type of dissection stereomicroscope will work |
| Biological Safety Cabinet class type A2 | Labconco | equivalent type will work | |
| tissue culture incubator | Thermoscientific | HEPA-class 100 | equivalent type will work |
| Sylvania fluorescent lamps OSFP5835HOECO | Bulbtronics | 31850 | |
| 0.2 µm pore-size Acrodisc syringe filter | VWR | 4192 | |
| 10 ml Luer-lok syringe | VWR | BD309604 | |
| 60 ml Luer-lok syringe | VWR | BD309653 | |
| NaHCO3 | FischerScientific | S233-500 | |
| CaCl2 | ThermoScientific | C79-500 | |
| MgCl2 | EMD Millipore | 5980 | |
| HBSS w/o Ca2+/Mg2+, w/o phenol red, Gibco | ThermoScientific | 14175-095 | |
| MEM w/o phenol red, Gibco | ThermoScientific | 5100-038 | |
| Horse serum, heat-inactivated | ThermoScientific | 26050-070 | |
| penicillin/streptomycin | VWR | 16777-164 | |
| Ultrapure low melting point agarose | ThermoScientific | 16520-100 | |
| ethanol, absolute | ThermoScientific | BP2818-4 | |
| 2-phenoxyethanol | Sigma | 77699 | |
| Corning Cell-Tak cell and tissue adhesive | VWR | 354240 | |
| refractive index liquid | Cargille Lab | 1803Y | |
| Nikon A1 multiphoton microscope equipped with a MaiTai infrared laser | Nikon | equivalent system will work | |
| 40x Apo long-distance water immersion objective (N.A. 1.15) | |||
| environmental chamber equipped with insert for 35 mm petridishes | Okolab | equivalent system will work | |
| NIS analysis software | Nikon |
References
- Fausett, B. V., Goldman, D. A role for alpha1 tubulin-expressing Muller glia in regeneration of the injured zebrafish retina. J.Neurosci. 26 (23), 6303-6313 (2006).
- Kassen, S. C., et al. Time course analysis of gene expression during light-induced photoreceptor cell death and regeneration in albino zebrafish. Dev.Neurobiol. 67 (8), 1009-1031 (2007).
- Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina. J.Neurobiol. 44 (3), 289-307 (2000).
- Bernardos, R. L., Barthel, L. K., Meyers, J. R., Raymond, P. A. Late-stage neuronal progenitors in the retina are radial Muller glia that function as retinal stem cells. J.Neurosci. 27 (26), 7028-7040 (2007).
- Nelson, C. M., Ackerman, K. M., O’Hayer, P., Bailey, T. J., Gorsuch, R. A., Hyde, D. R. Tumor necrosis factor-alpha is produced by dying retinal neurons and is required for Muller glia proliferation during zebrafish retinal regeneration. J.Neurosci. 33 (15), 6524-6539 (2013).
- Lahne, M., Li, J., Marton, R. M., Hyde, D. R. Actin-Cytoskeleton- and Rock-Mediated INM Are Required for Photoreceptor Regeneration in the Adult Zebrafish Retina. J.Neurosci. 35 (47), 15612-15634 (2015).
- Nagashima, M., Barthel, L. K., Raymond, P. A. A self-renewing division of zebrafish Muller glial cells generates neuronal progenitors that require N-cadherin to regenerate retinal neurons. Development. 140 (22), 4510-4521 (2013).
- Sauer, M. E., Walker, B. E. Radioautographic study of interkinetic nuclear migration in the neural tube. Proc.Soc.Exp.Biol.Med. 101 (3), 557-560 (1959).
- Pearson, R. A., Luneborg, N. L., Becker, D. L., Mobbs, P. Gap junctions modulate interkinetic nuclear movement in retinal progenitor cells. J.Neurosci. 25 (46), 10803-10814 (2005).
- Baye, L. M., Link, B. A. Interkinetic nuclear migration and the selection of neurogenic cell divisions during vertebrate retinogenesis. J.Neurosci. 27 (38), 10143-10152 (2007).
- Del Bene, F., Wehman, A. M., Link, B. A., Baier, H. Regulation of neurogenesis by interkinetic nuclear migration through an apical-basal notch gradient. Cell. 134 (6), 1055-1065 (2008).
- Norden, C., Young, S., Link, B. A., Harris, W. A. Actomyosin is the main driver of interkinetic nuclear migration in the retina. Cell. 138 (6), 1195-1208 (2009).
- Becker, D. L., et al. Multiphoton imaging of chick retinal development in relation to gap junctional communication. J.Physiol. 585 (Pt 3), 711-719 (2007).
- Surzenko, N., Crowl, T., Bachleda, A., Langer, L., Pevny, L. SOX2 maintains the quiescent progenitor cell state of postnatal retinal Muller glia. Development. 140 (7), 1445-1456 (2013).
- Nickerson, P. E., et al. Live imaging and analysis of postnatal mouse retinal development. BMC Dev.Biol. 13, 24 (2013).
- Suzuki, S. C., Bleckert, A., Williams, P. R., Takechi, M., Kawamura, S., Wong, R. O. Cone photoreceptor types in zebrafish are generated by symmetric terminal divisions of dedicated precursors. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 110 (37), 15109-15114 (2013).
- Johnson, T. V., Martin, K. R. Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model. Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 49 (8), 3503-3512 (2008).
- Bull, N. D., Johnson, T. V., Welsapar, G., DeKorver, N. W., Tomarev, S. I., Martin, K. R. Use of an adult rat retinal explant model for screening of potential retinal ganglion cell neuroprotective therapies. Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 52 (6), 3309-3320 (2011).
- Kustermann, S., Schmid, S., Biehlmaier, O., Kohler, K. Survival, excitability, and transfection of retinal neurons in an organotypic culture of mature zebrafish retina. Cell Tissue Res. 332 (2), 195-209 (2008).
- Williams, P. R., Morgan, J. L., Kerschensteiner, D., Wong, R. O. In vitro imaging of retinal whole mounts. Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).
- Johnson, T. V., Oglesby, E. N., Steinhart, M. R., Cone-Kimball, E., Jefferys, J., Quigley, H. A. Time-Lapse Retinal Ganglion Cell Dendritic Field Degeneration Imaged in Organotypic Retinal Explant Culture. Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 57 (1), 253-264 (2016).
- Roehlecke, C., Schumann, U., Ader, M., Knels, L., Funk, R. H. Influence of blue light on photoreceptors in a live retinal explant system. Mol.Vis. 17, 876-884 (2011).
- Coutu, D. L., Schroeder, T. Probing cellular processes by long-term live imaging–historic problems and current solutions. J.Cell.Sci. 126 (Pt 17), 3805-3815 (2013).
- Thomas, J. L., Thummel, R. A novel light damage paradigm for use in retinal regeneration studies in adult zebrafish. J.Vis.Exp. 80, e51017 (2013).
- Conner, C., Ackerman, K. M., Lahne, M., Hobgood, J. S., Hyde, D. R. Repressing notch signaling and expressing TNFalpha are sufficient to mimic retinal regeneration by inducing Muller glial proliferation to generate committed progenitor cells. J.Neurosci. 34 (43), 14403-14419 (2014).
- Nelson, C. M., Gorsuch, R. A., Bailey, T. J., Ackerman, K. M., Kassen, S. C., Hyde, D. R. Stat3 defines three populations of Muller glia and is required for initiating maximal muller glia proliferation in the regenerating zebrafish retina. J.Comp.Neurol. 520 (18), 4294-4311 (2012).
- Gorsuch, R. A., Hyde, D. R. Regulation of Muller glial dependent neuronal regeneration in the damaged adult zebrafish retina. Exp.Eye Res. 123, 131-140 (2014).
- Zhao, X. F., Wan, J., Powell, C., Ramachandran, R., Myers, M. G., Goldman, D. Leptin and IL-6 family cytokines synergize to stimulate Muller glia reprogramming and retina regeneration. Cell.Rep. 9 (1), 272-284 (2014).
- Wan, J., Ramachandran, R., Goldman, D. HB-EGF is necessary and sufficient for Muller glia dedifferentiation and retina regeneration. Dev.Cell. 22 (2), 334-347 (2012).
- Lenkowski, J. R., et al. Retinal regeneration in adult zebrafish requires regulation of TGFbeta signaling. Glia. 61 (10), 1687-1697 (2013).
- Weber, I. P., Ramos, A. P., Strzyz, P. J., Leung, L. C., Young, S., Norden, C. Mitotic position and morphology of committed precursor cells in the zebrafish retina adapt to architectural changes upon tissue maturation. Cell.Rep. 7 (2), 386-397 (2014).
- Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing photodamage in live-cell microscopy. Methods Cell Biol. 114, 545-560 (2013).
- Bailey, T. J., Fossum, S. L., Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. The inhibitor of phagocytosis, O-phospho-L-serine, suppresses Muller glia proliferation and cone cell regeneration in the light-damaged zebrafish retina. Exp.Eye Res. 91 (5), 601-612 (2010).
- Lee, J. E., Liang, K. J., Fariss, R. N., Wong, W. T. Ex vivo dynamic imaging of retinal microglia using time-lapse confocal microscopy. Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 49 (9), 4169-4176 (2008).
- Zhao, L., et al. Microglial phagocytosis of living photoreceptors contributes to inherited retinal degeneration. EMBO Mol.Med. 7 (9), 1179-1197 (2015).
- Peri, F., Nusslein-Volhard, C. Live imaging of neuronal degradation by microglia reveals a role for v0-ATPase a1 in phagosomal fusion in vivo. Cell. 133 (5), 916-927 (2008).
- Morsch, M., et al. In vivo characterization of microglial engulfment of dying neurons in the zebrafish spinal cord. Front.Cell.Neurosci. 9, 321 (2015).
