本稿では、同時に血小板機能および凝固を測定止血の実験モデルを説明します。血小板およびフィブリンの蛍光をリアルタイムで測定し、血小板付着率、凝固速度と凝固の開始が決定されます。モデルは、輸血用の濃縮物で流下血小板凝固促進特性を決定するために使用されます。
止血のマイクロ流体モデルは、流体力学的剪断の条件下で血小板機能を評価するが、抗凝固剤の存在下では、この分析は、血小板沈着のみに制限されています。 Ca 2+依存性凝固および血小板機能との間の複雑な関係は、分析前に血液の慎重かつ制御再石灰が必要です。私たちのセットアップはサンプルうっ滞せずに迅速な再石灰を有効にする、直前灌流に血液を流れるに集中した Ca 2+ / Mgの2+バッファを供給するY字型の混合流路を、使用しています。両方のリザーバ間の流速における10倍の差が希釈を最小化します。カルシウム再血液はその後、コラーゲンコーティングされた分析チャンバで灌流され、差動標識は蛍光ビデオ顕微鏡を使用して両方の血小板およびフィブリン沈着のリアルタイムイメージングを可能にします。システムは、標準化の可能性を増加させる、唯一の市販のツールを使用しています。 throの再構成バンクからの血小板とmbocytopenic血液は、この研究領域での使用を証明し、さらにモデルの血小板輸血を集中します。代表的なデータは、凝固開始及びフィブリン沈着は、我々のモデルのプライマリおよびセカンダリ止血の間の関係を確認し、血小板濃度に直線的に依存していたことを実証しました。 16灌流分の時間枠では、接触活性化は、通常のCa 2+およびMg 2+レベルに再石灰にもかかわらず、場所をとりませんでした。凝固第XIIa因子は、トウモロコシトリプシン阻害剤によって阻害された場合には、この時間枠は、血小板の凝血促進性の変化を評価することができるかなりのダイナミックレンジを示しても長かったです。コラーゲンと組織因子の共固定化は著しく、その速度凝固開始までの時間を減少させたが、ありません。組織因子および/または接触経路を研究するためのオプションは、アッセイの汎用性と有用性を向上させます。
一次および二次止血はもともと2つの比較的分離可能な生化学的プロセスとして概念化されました。二次止血がプロテアーゼカスケードは不溶性フィブリンを形成することを可能にする、静脈の血流の下で凝固を支配するように見られた一次止血は、血小板のための重要な役割で、動脈流条件の主要な貢献者として見られていました。過去数十年は、血小板活性化および凝集を認め、ほぼこの伝統的な見方を再形成している相互に依存していると、すべての(非極端な)流体力学的環境における生理学的および病理学的止血の際にも同様に重要なプロセスです。このビューには、妥当性、適用性とユーティリティ1上の多くの残りの質問はあるものの、総合的に全血液凝固を測定するために考案されたアッセイは、ますます使用されている診療所、に翻訳されています。
我々は最近、血小板の機能解析を公開しました赤血球、血漿、および血小板の正常な量を含有する試料と、輸血2のインビトロモデルにおける線維性コラーゲンでコーティングされたマイクロ流体フローチャンバーを使用して濃縮します。この方法は、トロンビン生成およびイオン化カルシウム(Ca 2+)に依存している二次止血のないか、または限られた関与を示唆していない、ヘパリンまたはヒルジン抗凝固処理した血液を使用しています。マイクロ流体の流れの下で止血のすべての側面を含むようにこのようにトロンビン形成をサポートし、するために、我々は今、遊離Ca 2+を含む、同じ技術プラットフォーム上の相補的方法を開発しました。この方法では、血小板沈着およびフィブリン形成、血小板濃縮物の質を評価するために、血小板輸血のモデルに再検討することができます。
この方法では、血小板及びフィブリノーゲンが完全に発光スペクトルを分離しているフルオロフォアで標識されています。デュアルカラー、リアルタイムビデオ顕微鏡は、その後の分析を可能にします一次血小板付着、ならびに凝固の開始とフィブリン沈着。静的な血液へのCa 2+の添加は、灌流の前に、必然的に容器内の接触が開始した凝固の原因となりますので、このタイプのアッセイにおける重要な変数は、再石灰です。この開始は原因灌流前にチューブとバイオチップの注入口の目詰まりにバイアス読み出しをでしょう。したがって、我々の方法では、クエン酸は、血液を抗凝固処理およびCa 2+含有バッファーは、Y字型の入口チャンバの上部の脚を通して別々にポンピングされます。成分は、コラーゲン単独または組換えヒト組織因子(rhTF)との組み合わせで用いてコーティングされた分析チャンバに入る前に、灌流中に混合されます。バッファに別々のポンプの流速およびCa 2+の濃度を適合させることにより、最終的な血液試料の10%希釈が起こります。
この拡張プロトコルを使用して、我々は凝塊の寄与を実証しますションXII因子(FXII)および血小板濃度は、流れの下で経路凝固開始を連絡します。我々のデータはまた、コラーゲンと一緒rhTFをコーティングすることにより、組織因子経路を同時に測定することができることを示しています。
血小板輸血は、予防または出血を止めるために血小板減少症患者のために処方される濃縮物。その臨床的影響は、最近、60年代、70年代における小児患者の生存率の増加率は、(血小板)輸血医療の改善に主に起因していたことを想起し、急性白血病12の歴史的なレビューで強調されました。血小板濃縮物はまた、急性外傷または手術中の出血を止めるために使用されます。これらの条件では、急速に止血を開始する優れた凝固促進特性を有する血小板が好ましいが、血小板濃縮物は、自発的なドナーの寄付から調製されると、薬理学的な薬物療法とは異なり、だけではなく、(化学)組成によって準備することによって標準化されています。したがって、血液銀行の分野でいくつかの質問には、最適な寄付モダリティ、保存条件、輸血慣行上のものを含め、応答がありません。 PLの分野ではatelet(輸血)生物は、細胞の循環からのクリアランス、止血に輸血血小板の貢献、またはその免疫学上の多くの質問も未解決のまま。
血小板機能解析のための多数の実験技術が利用可能であるが、これらは主に凝集や脱顆粒13のように、血小板機能の特異側面に取り組みます。広く血小板および血小板濃縮物を評価するために、止血の包括的なモデルが不可欠であり、これらは流体力学を含める必要があります。血液レオロジーは、抗凝固療法は、Caを防ぎ2+および/またはトロンビンは、クエン酸塩またはヘパリン、それぞれ2の存在に参加する場合でも、正しく止血14、15または血栓症16時の血小板の挙動を解釈することが重要です。流れ17の下で、凝固および血小板機能間の相互作用を研究するために、同様に、 図18に示すように 、正常なトロンビン生成が要求され、従って、遊離Ca 2+。防止策「アーティファクト」または凝固の制御不能な活性化はできるだけ取られるべきであるため、これらの条件下で止血を研究するための実験は、複雑です。さらに、多くの専門の研究グループが使用するカスタムメイドのハードウェア19、20、実質的な研究室間のばらつきの原因となる5。このアプローチの典型的な制約は、矩形の容器、非拍動流プロファイル、および非ヒト表面コーティング5の使用です。ここで説明するアッセイは、商業的に利用可能なツールを使用するため、標準化に適してもよいです。
血液が人体内に含まれていない一度凝固カスケード反応を容易に活性化されているので、制御再石灰は極めて重要なステップです。 TCa 2+緩衝液が静的血液に大量に供給された場合、凝固は必然的に、最終的にチューブが詰まるとデータバイアス、行われるので、O、反応性コラーゲン表面上だけ灌流前に延期する必要があるの Ca 2+のこの加算を達成解釈(データは示さず)。この問題を解決するには、分析室へ向かう途中で灌流の間の対流と拡散力による混合を可能にする、別々のCa 2+緩衝液と血液を送り出すことです。完全な混合は、混合と分析室との間のチューブ46 cmのセグメントで実現されます。この長さは、試薬の最適な滞留時間を算出したが、使用流量で灌流中の質量および対流輸送21の基本法則(千秒-1)に基づいて混合します。このアプローチは、制御可能で再現性のあることが判明しました。
凝固の接触活性化は時々簡単なのアーティファクトと見られています血液サンプリングおよび凝固時間を解釈する際に回避すべき。したがって、我々は、阻害剤の非存在下で、接触誘発性凝固は、灌流の16.7分(±3.7分)で開始する、ことを実証しました。たFXIIa媒介接触活性化を阻害するためのCTIの存在下で、凝固実験(30分)の任意に定義された過程で開始されません。この実験のウィンドウには、プロまたは抗血栓あるサンプルを識別するのに十分な長さです。接触活性化による凝固が人工表面に接触し、血液の望ましくない結果であることができるにもかかわらず、我々のデータは、血小板の明確な生物学的線量効果を実証します。 FXII、血小板ポリリン酸10、ホスファチジルセリン分布22、および血小板微粒子に関する最近の調査結果は23が実際に 、止血に重要な貢献者として、電子を接触経路の凝固を再評価しているので、これは、輸血医療のために重要であり得ます特別に血栓24の文脈インチ成功した凝固は、これらの要因に依存することが示されている場合、例えば、患者における血小板輸血の可変収率またはバンク血小板の可変ホスファチジルセリンの発現は、このように治療効果の変動を誘導し得ます。
コラーゲンとrhTFを脂質化の同時固定化することによって、外因性凝固経路、またはTF経路は、コラーゲン上の血小板沈着の間に活性化されます。これは、TFを有する細胞や組織との接触に血液をもたらす傷害のモデルとして、その最も包括的なモードに分析を拡張します。我々のデータは、コラーゲンとTFとの共固定化は、凝固開始の瞬間を減少するが、凝固の速度を変化させないことを示しています。注目すべきは、表面に固定化されたrhTFの量は、このモデル25、26で重要な変数であると指定された研究の中に標準化されるべきです。 PRESENで接触活性化が防止されるので、CTIのCEが、TF経路が独占的に研究することができる(図示せず)。
結論として、我々の実験セットアップはバンク血小板と血小板減少症、血液の再構成および流体力学的流動下でのカルシウム依存性血小板沈着およびフィブリン形成による止血のモデルによる輸血のモデルを組み合わせたものです。このアッセイは、バンク血小板および血小板濃縮物の調製技術は、これに持っている効果の凝固促進性に関する質問に答えるために使用されます。
The authors have nothing to disclose.
この研究はベルギー赤十字・フランダース血液サービスの研究開発のための財団によってサポートされていました。契約番号BOF30290744でプロジェクトに付与されたゲント大学から – 私たちは、 "Bijzonder onderzoeksfond」(特別研究基金BOF)が提供する財政支援を認めます。
1 mL Syringe | BD | A00434 | |
10 mL Syringe | BD | 309604 | |
2 mL Syringe | BD | 307727 | |
Alexa Fluor 405 | Life Technologies | A30100 | The manufacturer's manual was followed for labeling of fibrinogen |
BD vacutainer Eclipse | Becton, Dickinson and Company | 368650 | Blood collection needle with preattached holder |
BD vacutainer tube with EDTA | Becton, Dickinson and Company | 368856 | |
BD vacutainer tube with Sodium Citrate | Becton, Dickinson and Company | 366575 | |
Blocking buffer | in house preparation | in house preparation | 1.0% (w/v) bovine serum albumin and 0.1% (w/v) glucose in HBS |
Calcein AM | Molecular probes | C1430 | |
Coagulation buffer | in house preparation | in house preparation | 10mM CaCl2 and 3.75 mM MgCl2 in HBS |
Conical tube 15mL | Greiner bio-one | 1888271 | |
Conical tube 50mL | Greiner bio-one | 227261 | |
Corn trypsin inhibitor (CTI) | Enzyme Research Laboratories | CTI | |
Denaturated alcohol | Fiers | T0011.5 | |
DiOC6 | Sigma-Aldrich | 318426 | 3,3′-Dihexyloxacarbocyanine iodide – 1mM solution in DMSO |
Exigo microfluidic pump | Cellix | EXIGO-PC-FS7.0-MF | |
Fibrinogen | Sigma-Aldrich | F3879 | Labelled in house with AF 405 – stock concentration 10.7 mg/mL |
Hematology analyzer | Sysmex | pocH-100i | |
HEPES buffered saline (HBS) | in house preparation | in house preparation | 10mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffered saline (0.9% (w/v) NaCl, pH 7.4 |
Horm Collagen | Takeda/Nycomed | 1130630 | Native equine tendon collagen (type I) Isotonic glucose solution to dilute collagen is supplemented |
Humidified box | Cellix | HUMID-BOX | |
Incubation water bath | GFL | 1013 | |
Microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | equipped with a colibri-LED and high resolution CCD camera |
Mirus Evo Nanopump | Cellix | 188-MIRUS-PUMP-EVO | with Multiflow8 |
Pipette | Brand | A03429 | |
Pipette tips 100-1000 | Greiner bio-one | 740290 | |
Pipette tips 1-10 | Eppendorf | A08928 | |
Pipette tips 2-200 | Greiner bio-one | 739280 | |
Platelet concentrate orbital shaker | Helmer | PF-48i | |
Precision wipes | Kimtech | 5511 | |
Pepsin solution | Hanna instrument | HI7073L | 2g pepsin per 75 ml solution, Protein cleaning solution with pepsin |
Recombinant Human Tissue Factor Innovin | Dade Berhing | B4212-40 | rhTF with synthetic phospholipids |
Software microscope | Zeiss | N/A | ZEN 2012 |
Sterile docking device | Terumo BCT | TSCD | |
Table Top Centrifuge | Eppendorf | 521-0095 | |
Tube Roller | Ratek | BTR5-12V | |
Tubing Sealer | Terumo BCT | AC-155 | |
Vena8 syringe connector pin | Cellix | CONNECTORS-B1IC-PACK100 | |
Vena8 Fluoro+ Biochips | Cellix | 188V8CF-400-100-02P10 | Coated biochip |
Vena8 Needles | Cellix | SS-P-B1IC-B1OC-PACK200 | |
Vena8 Tubing | Cellix | TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F | |
VenaDelta Y1 Biochips | Cellix | VDY1-400-100-01-02 | Mixing biochip |
Vortex mixer | VWR | 58816-121 | |
ZEN2012 software | Zeiss |