Imagerie Neurones dans les sections du cerveau épais Utilisation du Golgi-Cox Méthode
Summary
Nous présentons un protocole d'utilisation de la méthode de coloration de Golgi-Cox dans des coupes de cerveau d'épaisseur, afin de visualiser les neurones avec de longs arbres dendritiques contenus dans des échantillons de tissus individuels. Deux variantes de ce protocole sont également présentées qui impliquent violet contre-coloration crésyl, et le gel des cerveaux non transformés pour le stockage à long terme.
Abstract
La méthode Golgi-Cox de coloration des neurones a été employé pendant plus de deux cents ans pour faire progresser notre compréhension de la morphologie des neurones dans les échantillons de cerveau histologiques. Bien qu'il soit préférable d'un point de vue pratique pour préparer des coupes du cerveau à la plus grande épaisseur possible, afin d'augmenter la probabilité d'identifier les neurones colorés qui sont entièrement contenus dans les sections individuelles, cette approche est limitée du point de vue technique par la distance de travail de haut -magnification objectifs de microscope. Nous rapportons ici un protocole pour colorer les neurones en utilisant la méthode Golgi-Cox dans des coupes de cerveau de souris qui sont coupées à une épaisseur de 500 um, et de visualiser les neurones tout au long de la profondeur de ces sections à l'aide d'un microscope droit muni d'une haute résolution 30X de silicone 1,05 NA objectif à immersion dans l'huile qui a une distance de travail de 800 um. Nous présentons également deux variantes utiles de ce protocole qui peut être utilisé pour la surface de contre-colorermonté des coupes de cerveau avec le colorant de Nissl violet de crésyle, ou de geler les cerveaux entiers pour le stockage à long terme avant la coupe et le traitement final. Le protocole principal et ses deux variantes produisent des coupes de cerveau épais tachés, tout au long de laquelle les arbres dendritiques complet des neurones et des épines dendritiques peuvent être de manière fiable visualiser et de quantifier.
Introduction
La visualisation des neurones individuels dans des échantillons de tissus permet de l'analyse in situ des caractéristiques morphologiques des neurones, ce qui a considérablement fait progresser notre compréhension du cerveau et comment elle peut être influencée par la maladie endogène ou des facteurs environnementaux exogènes. La méthode de coloration Golgi-Cox est un rapport coût-efficacité, des moyens relativement simples de coloration d'un échantillon aléatoire de neurones dans le cerveau. D' abord développé par Golgi 1 et modifié par Cox 2 dans les années 1800, les chercheurs ont affiné cette technique au cours des années à produire des neurones clairs, bien colorés qui peuvent être utilisés pour visualiser et de quantifier à la fois la morphologie des arbres dendritique et la densité de la colonne vertébrale 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9.
Une considération importante technique pour la visualisation des neurones colorés dans les sections du cerveau est l'épaisseur de la tranche maximale, qui est limitée par la distance de travail des objectifs disponibles de microscope à fort grossissement / haute résolution. Objectifs communs d'immersion d'huile dans les années 60 – 100X gamme offrent une excellente résolution, mais sont limités par leurs distances de travail qui ne sont généralement pas supérieure à 200 um. Les coupes de cerveau coupées à 200 um gamme peuvent être adéquates pour visualiser certains types de neurones qui peuvent être contenus à l'intérieur de cette épaisseur de tranche, par exemple des neurones pyramidaux dans les couches superficielles du cortex cérébral 10, 11, 12, les neurones pyramidaux de la région CA1 de la hippocampe 13, 14, et les cellules granulaires du gyrus denté de l'hippocampe 15. Neurones avec relativement plusarbres dendritiques, tels que les neurones pyramidaux dans les couches profondes du cortex cérébral que pour la souris peut dépasser de plus de 800 um à partir du corps de la cellule 16, fournissent un plus grand défi , car les cerveaux devraient être sectionné à un angle idéal pour contenir l'ensemble de l' arbre dendritique à moins de 200 um tranches. Cela peut ne pas être encore possible si un dendrites ou l'une de ses branches s'étendent dans la direction rostrale ou caudale. Bien qu'il soit possible de remédier à cette limitation en traçant un neurone à travers plusieurs sections du cerveau adjacentes, cette approche présente un défi technique important dans l' alignement des sections avec précision pour le traçage 17. Une approche plus pratique serait de visualiser les neurones entiers contenus dans les sections du cerveau qui sont découpées à une plus grande épaisseur.
Nous rapportons ici une technique pour colorer les neurones dans 400 – coupes de cerveau d'épaisseur 500 um de souris en utilisant la méthode Golgi-Cox, et de visualiser leur morphology en utilisant un objectif à immersion dans l'huile silicone à haute résolution qui a une distance de travail de 800 um. Le protocole d'imprégnation et de traitement Golgi-Cox que nous décrivons est modifié à partir de l' un des protocoles modernes les plus cités dans la littérature 6. Notre approche avec des coupes de cerveau épais offre l'avantage d'augmenter la probabilité d'identifier les neurones de tout type qui sont entièrement contenu dans la section. En plus du protocole principal, nous présentons également deux variantes qui offrent des avantages uniques: (1) coloration Golgi-Cox avec le contre-colorant violet de crésyl sur la surface des sections montées, afin de définir les limites des régions du cerveau et d'identifier les couches de la cortex cérébral, et (2) la coloration de Golgi-Cox avec une étape intermédiaire de congélation pour le stockage à long terme des cerveaux entiers imprégnés avant la coupe et le traitement final.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous décrivons ici un protocole de coloration Golgi-Cox ainsi que deux variantes utiles pour visualiser les neurones dans les sections du cerveau épais. Comme le montrent les résultats représentatifs, l'utilisation d'un objectif à haute résolution qui a une longue 800 um distance de travail permet la visualisation fiable de l'ensemble des neurones tout au long de la profondeur des coupes de cerveau coupées à 500 um. Cette étude des coupes de cerveau relativement épaisses augmente la probabilité qu…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par une subvention à la découverte de SBCDC du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG), une subvention d'infrastructure de recherche du Fonds des leaders John R. Evans à SBCDC de la Fondation canadienne pour l'innovation (numéro de projet CFI 30381), et par une subvention à la découverte du CRSNG à NJM du. ELL a été soutenu par une bourse d'études supérieures de l'Ontario et par une bourse d'études OEV du Collège vétérinaire de l'Ontario à l'Université de Guelph. CDS a été pris en charge par un poste d'assistant de recherche des étudiants de premier cycle du CRSNG. ALM a été soutenu par une bourse d'études Alexander Graham Bell du CRSNG et par une bourse d'études OEV du Collège vétérinaire de l'Ontario à l'Université de Guelph.
Materials
| potassium dichromate | Fisher Scientific | P188-100 | Hazardous |
| potassium chromate | Fisher Scientific | P220-100 | Hazardous |
| mercuric chloride | Fisher Scientific | S25423 | Hazardous |
| Whatman grade 1 filter paper | Fisher Scientific | 1001-185 | |
| isoflurane | Pharmaceutical Partners of Canada | CP0406V2 | |
| 20 mL scintillation vial | Fisher Scientific | 03-337-4 | |
| sucrose | Bioshop Canada | SUC700.1 | |
| sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S5011-500G | |
| sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S9390-500G | |
| 50 mL conical tube | Fisher Scientific | 12-565-271 | |
| isopentane | Fisher Scientific | AC126470010 | also known as 2-methylbutane. Hazardous |
| agar | Sigma Aldrich | A1296-100G | |
| small weigh dish | Fisher Scientific | 02-202-100 | |
| vibratome | Leica | VT1000 S | |
| 6 well tissue culture plates | Fisher Scientific | 08-772-1b | |
| mesh bottom tissue culture inserts | Fisher Scientific | 07-200-214 | |
| paraformadelhyde, 16% | Electron Microscope Sciences | 15710-S | Hazardous |
| ammonium hydroxide | Fisher Scientific | A669S-500 | Hazardous |
| Kodak Fixative A | Sigma Aldrich | P7542 | |
| superfrost plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| CitroSolv clearing agent | Fisher Scientific | 22-143-975 | |
| anhydrous ethyl alcohol | Commercial Alcohols | N/A | |
| cresyl violet | Sigma Aldrich | C1791 | |
| permount | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| upright microscope | Olympus | BX53 model | |
| colour camera, 12 bit | MBF Biosciences | DV-47d | QImaging part 01-MBF-2000R-F-CLR-12 |
| three-dimensional motorized microscope stage, controller and enoders | MBF Biosciences | N/A | Supplied and integrated with microscope by MBF Biosciences |
| 4x microscope objective | Olympus | 4x 0.16 N.A. UplanSApo | |
| 10x microscope objective | Olympus | 10x 0.3 N.A. UPlan FL N | |
| 30x microscope objective | Olympus | 30x 1.05 N.A. UPlanSApo | |
| 60x microscope objective | Olympus | 60x 1.42 N.A. PlanAPO N | |
| silicone immersion oil | Olympus | Z-81114 | |
| Neurolucida software | MBF Biosciences | Version 10 | |
| ImageJ software | U. S. National Institutes of Health | Current version | With the OME Bio-Formats plugin installed |
| Photoshop software | Adobe | version CS6 |
References
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