Imaging Neurone innerhalb Dickhirnschnitten Mit der Golgi-Cox-Methode
Summary
Wir präsentieren ein Protokoll der Golgi-Cox-Färbung in dicken Hirnschnitten für die Verwendung, um Neuronen mit langen Dendritenbäume innerhalb einzelner Gewebeproben enthalten ist, zu visualisieren. Zwei Varianten dieses Protokolls werden auch vorgestellt, Kresylviolett Gegenfärbung einzubeziehen und das Einfrieren von nicht verarbeiteten Gehirne für die Langzeitlagerung.
Abstract
Der Golgi-Cox-Methode von Neuron-Färbung ist seit mehr als zweihundert Jahren beschäftigt unser Verständnis der neuronalen Morphologie innerhalb histologischen Hirnproben vorzurücken. Zwar ist es aus praktischer Sicht zu bevorzugen ist, um Hirnschnitt bei der größten Dicke möglich ist, um die Wahrscheinlichkeit des Identifizierens stained Neuronen zu erhöhen, die vollständig innerhalb einzelnen Abschnitte enthalten ist, herzustellen, ist dieser Ansatz aus technischen Sicht von dem Arbeitsabstand von hohen begrenztem Lineare Wiedergabe Mikroskopobjektive. Wir berichten hier über ein Protokoll Neuronen färbt das Golgi-Cox-Verfahren in Mausgehirnschnitte verwenden, die bei 500 & mgr; m Dicke geschnitten werden, und Neuronen in der gesamten Tiefe dieser Abschnitte zur Visualisierungen mit einem hochauflösenden 30X 1,05 NA Silikon ausgerüstet ein aufrechtes Mikroskop Ölimmersionsobjektiv, das einen 800 um Arbeitsabstand aufweist. Wir berichten auch zwei nützliche Varianten dieses Protokolls, das verwendet werden kann, um die Oberfläche des gegenzufärbenmontiert Gehirnschnitt mit der Kresylviolett Nissl-Färbung, oder ganze Gehirne für die Langzeitlagerung vor dem Schneiden und Endverarbeitung gefrieren. Das Hauptprotokoll und seine zwei Varianten produzieren gefärbte dicke Hirnschnitten, wobei durchwegs voll Neuron Dendritenbäume und Dendriten Stacheln können zuverlässig sichtbar gemacht und quantifiziert werden.
Introduction
Die Visualisierung von einzelnen Neuronen innerhalb von Gewebeproben ermöglicht die de – situ – Analyse von Neuronen morphologischer Eigenschaften, die unser Verständnis des Gehirns deutlich fortgeschritten sind und wie sie durch endogene Krankheit oder exogene Umweltfaktoren beeinflusst werden. Die Golgi-Cox-Färbeverfahren sind ein kostengünstiges, relativ einfaches Mittel eine Stichprobe von Neuronen im Gehirn Anfärben. Zuerst von Golgi 1 entwickelt und modifiziert von Cox 2 in den 1800er Jahren haben die Forscher weiter verfeinert , diese Technik im Laufe der Jahre klar, gut gefärbten Neuronen zu erzeugen , die verwendet werden können , zu visualisieren und sowohl Dendritenbaum Morphologie und Wirbelsäule Dichte 3, 4, zu quantifizieren 5, 6, 7, 8, 9.
Eine wichtige technische Überlegungen für die Visualisierung von gefärbten Neuronen in Hirnschnitten ist die maximale Schichtdicke, die von der Arbeitsabstand der verfügbaren hochvergrößernde / hochauflösendes Mikroskop-Objektive begrenzt ist. Gemeinsame Öl-Tauchziele in den 60 – 100X Bereich hervorragende Auflösung bieten, sind aber durch ihre Arbeitsabstände begrenzt, die typischerweise nicht größer sind als 200 & mgr; m. Hirnschnitte bei der 200 um Bereich schneiden kann ausreichend sein , bestimmte Neuron Typen sichtbar zu machen , die innerhalb dieser Schichtdicke enthalten sein können, beispielsweise pyramidalen Neuronen in flachen Schichten der Hirnrinde 10, 11, 12, pyramidalen Neuronen in der CA1 – Region des Hippocampus 13, 14 und Körnerzellen im Gyrus dentatus des Hippocampus 15. Neurone mit relativ mehrDendritenbäume wie pyramidalen Neuronen in tiefen Schichten des Hirnrinde , die für Maus kann mehr als 800 erstrecken , um von dem Zellkörper 16, eine größere Herausforderung bieten , da Gehirne in einem perfekten Winkel geschnitten werden müßten den gesamten Dendriten Baum enthalten innerhalb von 200 & mgr; m-Scheiben. Dies kann auch nicht durchführbar sein, wenn ein Dendrit oder eine ihrer Verzweigungen in der rostralen oder kaudalen Richtung erstrecken. Während es möglich ist , diese Einschränkung zu adressieren , indem ein Neuron über mehrere benachbarte Hirnschnitte Tracing stellt dieser Ansatz eine erhebliche technische Herausforderung , die Abschnitte genau in Ausrichtung 17 zur Verfolgung. Ein praktischer Ansatz wäre gesamte Neuronen in Hirnschnitten enthalten ist, zu visualisieren, die mit einer größeren Dicke geschnitten werden.
Wir berichten hier über eine Technik Neuronen zu färben innerhalb von 400 bis 500 & mgr; m dicker Hirnschnitten von Mäusen, die die Golgi-Cox-Methode und dessen mo zu visualisierenrphology unter Verwendung eines hochauflösenden Silizium-Ölimmersionsobjektiv, das einen 800 um Arbeitsabstand aufweist. Das Golgi-Cox Imprägnierung und Verarbeitungsprotokoll , das wir beschreiben , wird aus einem der zitierten modernen Protokollen in der Literatur 6 modifiziert. Unser Ansatz mit dicken Hirnschnitten bietet den Vorteil einer Erhöhung der Wahrscheinlichkeit der Identifizierung Neuronen jeglicher Art, die im Abschnitt vollständig enthalten sind. Neben dem Hauptprotokoll wir auch zeigen zwei Varianten, die einzigartige Vorteile bieten: (1) Golgi-Cox-Färbung mit Cresylviolett Gegenfärbemittel auf der Oberfläche der montierten Teile, um die Grenzen der Hirnregionen zu definieren und Schichten des identifizieren Großhirnrinde, und (2) Golgi-Cox-Färbung mit einem Zwischengefrierschritt für die lang~~POS=TRUNC von imprägniertem gesamtem Gehirn vor dem Schneiden und Endverarbeitung.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir beschreiben hier ein Golgi-Cox Färbeprotokolls zusammen mit zwei nützliche Varianten für Neuronen im dicken Hirnschnitten sichtbar zu machen. Wie in den Repräsentative Ergebnisse gezeigt, die Verwendung eines hochauflösenden Ziel, die eine lange 800 & mgr; m Arbeitsabstand hat ermöglicht die zuverlässige Visualisierung der gesamten Neuronen über die gesamte Tiefe des Gehirns bei 500 & mgr; m geschnitten Abschnitte. Diese Studie von relativ dicken Hirnschnitten erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass gef…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von einem Discovery-Grant CDCB aus den Natur- und Ingenieurwissenschaften Research Council of Canada (NSERC) unterstützt, ein John R. Evans Leaders Fund Forschungsinfrastruktur Zuschuss CDCB aus Kanada Foundation for Innovation (CFI Projektnummer 30381) und durch eine Entdeckung Grant NJM von NSERC. ELL wurde von einem Ontario Graduate Scholarship und von einem OVC Stipendium des Ontario Veterinary College an der University of Guelph unterstützt. CDS wurde durch einen Bachelor-Student Aspirantur von NSERC unterstützt. ALM wurde von einem Alexander Graham Bell Stipendium NSERC und von einem OVC Stipendium des Ontario Veterinary College an der University of Guelph unterstützt.
Materials
| potassium dichromate | Fisher Scientific | P188-100 | Hazardous |
| potassium chromate | Fisher Scientific | P220-100 | Hazardous |
| mercuric chloride | Fisher Scientific | S25423 | Hazardous |
| Whatman grade 1 filter paper | Fisher Scientific | 1001-185 | |
| isoflurane | Pharmaceutical Partners of Canada | CP0406V2 | |
| 20 mL scintillation vial | Fisher Scientific | 03-337-4 | |
| sucrose | Bioshop Canada | SUC700.1 | |
| sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S5011-500G | |
| sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S9390-500G | |
| 50 mL conical tube | Fisher Scientific | 12-565-271 | |
| isopentane | Fisher Scientific | AC126470010 | also known as 2-methylbutane. Hazardous |
| agar | Sigma Aldrich | A1296-100G | |
| small weigh dish | Fisher Scientific | 02-202-100 | |
| vibratome | Leica | VT1000 S | |
| 6 well tissue culture plates | Fisher Scientific | 08-772-1b | |
| mesh bottom tissue culture inserts | Fisher Scientific | 07-200-214 | |
| paraformadelhyde, 16% | Electron Microscope Sciences | 15710-S | Hazardous |
| ammonium hydroxide | Fisher Scientific | A669S-500 | Hazardous |
| Kodak Fixative A | Sigma Aldrich | P7542 | |
| superfrost plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| CitroSolv clearing agent | Fisher Scientific | 22-143-975 | |
| anhydrous ethyl alcohol | Commercial Alcohols | N/A | |
| cresyl violet | Sigma Aldrich | C1791 | |
| permount | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| upright microscope | Olympus | BX53 model | |
| colour camera, 12 bit | MBF Biosciences | DV-47d | QImaging part 01-MBF-2000R-F-CLR-12 |
| three-dimensional motorized microscope stage, controller and enoders | MBF Biosciences | N/A | Supplied and integrated with microscope by MBF Biosciences |
| 4x microscope objective | Olympus | 4x 0.16 N.A. UplanSApo | |
| 10x microscope objective | Olympus | 10x 0.3 N.A. UPlan FL N | |
| 30x microscope objective | Olympus | 30x 1.05 N.A. UPlanSApo | |
| 60x microscope objective | Olympus | 60x 1.42 N.A. PlanAPO N | |
| silicone immersion oil | Olympus | Z-81114 | |
| Neurolucida software | MBF Biosciences | Version 10 | |
| ImageJ software | U. S. National Institutes of Health | Current version | With the OME Bio-Formats plugin installed |
| Photoshop software | Adobe | version CS6 |
References
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