향상된 순도와 다양성에 차 미세 아교 세포의 신속하고 세련된 CD11b를 자기 절연
Summary
여기, 우리는 시험 관내 실험에 대한 출생 마우스 새끼에서 미세 아교 세포를 분리하는 프로토콜 (1 일)을 제시한다. 단리 방법이 즉석에서 모두 높은 수율 및 순도, 소교 생물학의 해명을 목적으로 다양한 실험을 허용 다른 방법에 비해 상당한 이점을 생성한다.
Abstract
미세 아교 세포는 중추 신경계에 욕설 차 응답자이다; 그러나, 많은 신경 염증을 조절하는 역할에 대한 알 수없는 남아있다. 미세 아교 세포는 염증 스트레스를 측량에서 대 식세포 유사한 기능을 중배엽 세포이다. 고전 (M1 형) 및 대체 (M2 형) 대 식세포의 활성화는 더 나은 이러한 표현형은 파킨슨 병, 알츠하이머, 헌팅턴의 질병과 같은 신경 염증성 조건이 기본 상호 작용을 이해하기위한 노력의 일환으로 미세 아교 세포로 확장되었습니다. 시험관 실험에서 생체 환경에 확장 될 수있다 신속하고 신뢰할 수있는 결과는 차 미세 아교 세포를 제공 활용. 이것은 도전했다 최적 순도 적당한 수율을 달성하면서 미세 아교 세포를 단리 생체 실험을 통해 명백한 장점 않는다. 현재 사용중인 일반적인 방법 중 하나는 낮은 복구, 낮은 순도, 또는 두 가지 모두에서 고통 받고 있습니다. 여기서, 우리는 민주시간의 절반의 양으로 높은 세포 복구 및 순도 향상을 달성 열없는 CD11b를 자기 분리 방법의 구체화를 onstrate. 우리는 신경 염증과 신경 퇴행을 연구의 목적으로 차 미세 아교 분리의 매우 유용한 모델로이 최적화 방법을 제안한다.
Introduction
미세 아교 세포는 C-KIT + / CD45- 차별화 중배엽 기원 MYB 독립적 상주 식세포, 난황 1, 2의 혈액 섬 전구 세포를 erythromyeloid이다. 배아 미세 아교 세포는 중추 신경계 (CNS)을 식민되면, 그들은 분지 형태 3에 아메바에서 전환. 그들의 역동적 인 파급 효과가 잠재적 인 모욕 4 건강한 뇌 실질을 조사하고 있기 때문 성인 미세 아교 세포는 감시자로 분류됩니다. 미세 아교 세포는 중추 신경계의 세포 인구의 약 10 %에 기여하지만, 서로의 사이에 타일에 대한 그들의 능력은 실질 4, 5의 최대 스캐닝을 보장합니다. 이러한 α-synuclein의 6, 7, 아밀로이드 β-8, P 등의 위험 – 관련 분자 패턴 (DAMPS)예컨대 리포 폴리 사카 라이드 (LPS) (9)와 같은 athogen – 관련 분자 패턴 (PAMPs가)는 고전 아메바 액티브 상태로 복귀하고 산화 질소의 생산, 종양 괴사 인자 α (TNFα), 인터루킨 1β 특징으로하는 염증 반응을 촉진하는 미세 아교 세포를 활성화 (IL-1β), IL-6, IL-12, 및 CC 케모카인 리간드 모티프 2 내지 9, 10, 11. 병원성 α-synuclein의 축적 가지고있는 파킨슨 병과 같은 신경 염증성 조건에서, 신경 퇴행성주기는 더 미세 아교 세포 (7)의 고전적인 활성화를 추진,보다 통합 된 α-synuclein의 출시 도파민 신경 세포의 죽음에서 생성됩니다. 주변 대 식세포와 마찬가지로, 미세 아교 세포는 대안 항 염증성 사이토 카인 IL-4 및 IL-10의 존재 하에서 활성화하는 능력을 갖고 그들에게 효능을 제공 할 수있다염증이 11 신경 수리를 장려하고 감쇠 IAL. 이외에도 CNS에서의 면역 학적 역할에서, 미세 아교 세포는 개발 과정에서 시냅스 가지 치기를하여 신경 회로의 중요 규제로 기술되었다. 예를 들어, Cx3cr1- KO 마우스는 저밀도 및 미세 아교 세포 돌기 쪽 미성숙 시냅스 및 미개발 CNS (12)의 전기 생리 패턴 넘쳐나 리드 감소 시냅스 치기를 갖는다. 중추 신경계의 항상성에 이러한 생리 학적 복잡성과 미세 아교 세포의 다양한 기능적 역할을 이해하는 것은 신경 퇴행성 질환을 대상으로 치료제에 대한 검색에 매우 중요합니다.
neuroimmunology의 영역에서 생체 외 실험 때문에 역학적 연구에 대한 더 큰 가능성의 매우 바람직하며, 낮은 유지 보수 비용과 시간이 적게 걸리고 힘이 덜 드는 것에 대해. Furthermo다시, 세포 집단을 분리하는 능력은 소정의 조건에 따라 그 표적 세포의 기능을 묘사하는 것이 중요하다. 수많은 소교 분리 방법이 존재하지만, 그들은 광범위한 실험 13, 14, 15에 대해 상대적으로 높은 번호 및 순도를 얻을 수있는 능력에 의해 제한된다. 예를 들어, 분화 (11b)의 클러스터 (는 CD11b)는 단핵구, 대 식세포와 미세 아교 세포 (16)의 공통 표면 마커이다. CD11b를 악용하여 자기 분리하는 방법은 제 17 뇌 신생아 당 열 기반 접근법 수득 ~ 99.5 % 순도 및 ~ 1.6 × 106 미세 아교 세포로서 설명 하였다. 본 연구실은 최근 우리가 피코 에리 트린 접합하는 모노클로 날 항체 (PE)와 CD11b를 태깅하여 폴리스티렌 튜브에서 수행되는 열없는 CD11b를 자성 분리 방법 (15)을 개발 하였다. 특이 적 secondaRY 항체 PE 및 PE와 덱스 트란 착물한다. 일단 결합 된 덱스 트란 – 코팅 된 자성 입자는 항체 복합체의 덱스 트란 단부에 결합되는 도입된다. 마지막으로, 폴리스티렌 튜브는 미세 아교 분리를위한 자석에 배치됩니다. 이 방법은에 수율을 두 배로 ~ 신생아 뇌 당 만 ~ 97 %로 순도 감소의 비용으로 3.2 × 10 (6) 미세 아교 세포.
여기서, 우리는 신속하고 세련된 열이없는 CD11b를 자기 분리 프로토콜 (그림 1)를 보여줍니다. CD11b를 자기 분리 키트의 가격이 동일하기 때문에 이러한 개선 된 방법은 오리지널 열없는 방법처럼 가능한 남아있다. 완료 시간은 세포 생존 및 수율을 최대화 결정적 일 수 절반으로 감소된다. 특히,이 최적화 된 방법에서 얻어지는 ~ 순도> 99 %, 15 실험실에서 개발 원래 열없는 방법에서 얻어지는 순도 이상 현저한 개선이다. 가장 중요한 것은, CD11b를-PE빛으로부터 배양의 필요성을 제거하고 형광 현미경에 대한 빨강 채널의 사용을 허용, 사용되지 않습니다. 마지막으로, 원래는 CD11b 방법에서와 같이, 높은 수율 및 순도의 성상 세포 분획이 개선 된 방법으로 얻어진다. 성상은 항상성 기능 병태 생리 (18)과 관련하여 필수 불가결하다는 생각을지도하는 CNS에서 가장 많은 신경 교세포이다. 이 아교 세포는 아교 자신의 조사의 가능성을 예시, 영양 지원을 제공, 혈액 – 뇌 장벽을 형성하는 신경 전달 물질의 항상성을 유지, 손상, 신경에 대한 응답으로 아교 흉터를 형성, 학습 및 메모리 및 신경 염증 등 다양한 생리 기능에 중요한 역할을 생물학 (19). 형태와 미세 아교 세포와 성상 세포의 기능은 공 초점 현미경, 웨스턴 블롯, 정량 실시간 중합 효소 연쇄 반응 (QRT-PCR), G를 통해 확인되었다RIESS 아질산 분석하고, 루미 넥스 다중 사이토 카인 분석. 이 프로토콜에 의해 제공되는 정제는 시험관 실험에 중요한 모두, 미세 아교 또는 성상 세포의 순도, 빨강 채널의 가용성과 형광 현미경의 폭 넓은 응용에 관한 신뢰를 증가하고, 시간을 절약 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이전 페이지 소교 분리 방법은 다양한 단백질을 웨스턴 블롯에 의해 분석하고, RNA는 QRT-PCR에 의해 분석에 적합하지 않은 제한된 복구를 갖는다. 차동 부착 중성 트립신 처리 방법은 낮은 수율 소교 13, 14, 15 개의 일반적인 방법이다. 열 CD11b를 기반 접근법은 낮은 회복을 갖지만, 차동 부착 중성 트립신 13,</…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NS088206 및 ES026892 :이 작품은 건강 (NIH)의 국립 연구소 보조금에 의해 지원되었다. 더블유 유진과 린다 로이드 기증 의자 AGK하고 AK에 학장 교수도 인정된다.
Materials
| EasySep CD11b Separation Kit II | StemCell Technologies | 18970 | |
| EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| DMEM/F12 (1:1) (1x) | Life Technologies | 11330057 | |
| Sodium Pyruvate | Life Technologies | 11360070 | |
| MEM Non-essential amino acids (100x) | Life Technologies | 11140050 | |
| L-Glutamine (100x) | Life Technologies | 25030081 | |
| EDTA | Fisher Scientific | AM9260G | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | 13H469 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco by Life Technologies | 25200 | |
| Dulbecco's PBS | Gibco by Life Technologies | 14190250 |
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