बढ़ी पवित्रता और बहुमुखी प्रतिभा के साथ प्राथमिक Microglia का तेजी से और रिफाइंड CD11b चुंबकीय अलगाव
Summary
यहाँ, हम इन विट्रो प्रयोग के लिए प्रसव के बाद माउस पिल्ले से microglia अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल (दिन 1) प्रस्तुत करते हैं। अलगाव की इस तात्कालिक विधि उत्पन्न करता है दोनों उच्च उपज और पवित्रता, वैकल्पिक तरीकों में एक महत्वपूर्ण लाभ यह है कि microglial जीव विज्ञान का वर्णन करने के उद्देश्य से व्यापक रेंज प्रयोग अनुमति देता है।
Abstract
Microglia केंद्रीय तंत्रिका तंत्र अपमान करने के लिए प्राथमिक प्रतिसाददाताओं कर रहे हैं; हालांकि, ज्यादा neuroinflammation को विनियमित करने में उनकी भूमिका के बारे में अनजान बनी हुई है। Microglia mesodermal कोशिकाओं है कि भड़काऊ तनाव सर्वेक्षण में मैक्रोफेज की तरह ही काम कर रहे हैं। शास्त्रीय (एम 1 प्रकार) और वैकल्पिक (M2 प्रकार) मैक्रोफेज के सक्रियण भी बेहतर अंतर्निहित परस्पर क्रिया इन समलक्षणियों ऐसे पार्किंसंस, अल्जाइमर और हंटिंगटन रोग के रूप में neuroinflammatory की स्थिति में है को समझने के प्रयास में microglia के लिए बढ़ा दिया गया है। इन विट्रो प्रयोगों में प्राथमिक microglia का उपयोग तेजी से और विश्वसनीय परिणाम है कि इन विवो पर्यावरण के लिए बढ़ाया जा सकता है प्रदान करता है। हालांकि इस इन विवो प्रयोग से अधिक एक स्पष्ट लाभ, microglia अलग करते हुए इष्टतम पवित्रता की पर्याप्त पैदावार प्राप्त करने के लिए एक चुनौती रहा है। वर्तमान में उपयोग में आम तरीकों या तो कम वसूली, कम शुद्धता, या दोनों से ग्रस्त हैं। इस के साथ साथ, हम demस्तंभ से मुक्त CD11b चुंबकीय जुदाई विधि है कि एक उच्च सेल वसूली और आधे समय के लिए राशि में बढ़ाया पवित्रता को प्राप्त होता है के एक शोधन onstrate। हम neuroinflammation और neurodegeneration का अध्ययन करने के उद्देश्य से प्राथमिक microglial अलगाव की एक अत्यधिक उपयोगी मॉडल के रूप में इस अनुकूलित विधि का प्रस्ताव।
Introduction
Microglia mesodermal मूल के Myb स्वतंत्र निवासी मैक्रोफेज, जो सी किट + / CD45- से अलग जर्दी थैली 1, 2 के खून द्वीपों में पूर्वज erythromyeloid हैं। एक बार जब embryological microglia केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) उपनिवेश, वे एक डालियां फैला हुआ प्रपत्र 3 करने के लिए एक अमीबीय से संक्रमण। के बाद से उनकी गतिशील असर संभावित अपमान 4 के लिए स्वस्थ मस्तिष्क पैरेन्काइमा जांच ये वयस्क microglia चौकस के रूप में वर्गीकृत किया जाता है। हालांकि microglia केवल सीएनएस सेल की आबादी का लगभग 10% करने के लिए योगदान, आपस में टाइल करने की क्षमता पैरेन्काइमा 4, 5 की अधिकतम स्कैनिंग करता है। ऐसे α-synuclein 6, 7 और एमीलोयड-β 8 या पी के रूप में खतरे जुड़े आणविक पैटर्न (damps),इस तरह के lipopolysaccharide (LPS) 9 के रूप में athogen जुड़े आणविक पैटर्न (PAMPs), प्रतिष्ठित एक भड़काऊ प्रतिक्रिया अमीबीय सक्रिय राज्य को प्रत्यावर्तन और नाइट्रिक ऑक्साइड के उत्पादन, ट्यूमर परिगलन कारक-α (TNFα), इंटरल्यूकिन 1β की विशेषता को बढ़ावा देने के microglia को सक्रिय (आईएल 1β), आईएल -6, आईएल 12, और केमोकाइन सीसी मूल भाव ligand 2 9, 10, 11। ऐसे पार्किंसंस रोग के रूप में neuroinflammatory स्थिति, जिसमें रोगजनक α-synuclein जमा हो गया, एक न्यूरोडीजेनेरेटिव चक्र डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स, जो और अधिक एकत्रित α-synuclein जारी की मौत से बनाया जाता है, आगे microglia 7 के शास्त्रीय सक्रियण को बढ़ावा देने के। परिधीय मैक्रोफेज की ही तरह, microglia भी, वैकल्पिक रूप से विरोधी भड़काऊ साइटोकिन्स आईएल 4 और आईएल 10 की उपस्थिति में सक्रिय करने के लिए क्षमता हो सकती है उन्हें शक्तिशाली दे रही हैतंत्रिका मरम्मत को बढ़ावा देने और सूजन 2, 11 attenuating की ial। सीएनएस में उनकी प्रतिरक्षा भूमिकाओं के अलावा, microglia विकास के दौरान synapses प्रूनिंग द्वारा neuronal circuitry की महत्वपूर्ण नियामकों के रूप में वर्णित किया गया है। उदाहरण के लिए, Cx3cr1- KO चूहों कम घना microglia और कम अन्तर्ग्रथनी छंटाई, जो वृक्ष के समान कांटा, अपरिपक्व synapses, और एक अविकसित सीएनएस 12 के electrophysiological पैटर्न के एक अधिकता की ओर जाता है है। सीएनएस के homeostasis में इन शारीरिक जटिलताओं और microglia की विभिन्न कार्यात्मक भूमिकाओं को समझना न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों को लक्षित चिकित्सा विज्ञान के लिए खोज करने के लिए महत्वपूर्ण है।
Neuroimmunology के क्षेत्र में, इन विट्रो प्रयोगों यंत्रवत अध्ययनों के लिए अधिक से अधिक व्यवहार्यता की वजह से बहुत ही वांछनीय हैं, कम रखरखाव लागत, और कम समय और श्रम प्रधान होने के लिए। Furthermoफिर, सेल आबादी को अलग करने की क्षमता निर्धारित शर्तों के तहत उन लक्ष्य कोशिकाओं की कार्यक्षमता को चित्रित करने के लिए महत्वपूर्ण है। कई microglial अलगाव तरीके मौजूद हैं, लेकिन वे व्यापक प्रयोग 13, 14, 15 के लिए अपेक्षाकृत अधिक संख्या और पवित्रता प्राप्त करने के लिए अपनी क्षमता द्वारा सीमित हैं। उदाहरण के लिए, भेदभाव 11b का एक समूह (CD11b) monocytes, मैक्रोफेज, और microglia 16 का एक आम सतह मार्कर है। CD11b का शोषण करके, चुंबकीय जुदाई की एक विधि पहले एक स्तंभ आधारित दृष्टिकोण है कि झुकेंगे ~ 99.5% पवित्रता और नवजात मस्तिष्क 17 प्रति ~ 1.6 x 10 6 microglia के रूप में वर्णित किया गया था। हमारी प्रयोगशाला हाल ही में एक स्तंभ से मुक्त CD11b चुंबकीय जुदाई विधि 15 है, जो हम एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी phycoerythrin को संयुग्मित (पीई) के साथ CD11b टैग करके एक polystyrene ट्यूब में प्रदर्शन का विकास किया। एक bispecific secondary एंटीबॉडी पीई तथा पीई के साथ dextran परिसरों के लिए। एक बार ही, dextran में लिपटे चुंबकीय कणों का प्रवेश होता है जो एंटीबॉडी परिसर के dextran अंत करने के लिए बाध्य। अन्त में, polystyrene ट्यूब microglial अलगाव के लिए एक चुंबक में रखा गया है। यह दृष्टिकोण करने के लिए उपज दोगुनी ~ नवजात मस्तिष्क प्रति लेकिन ~ 97% करने के लिए पवित्रता को कम करने की कीमत पर 3.2 x 10 6 microglia।
इस के साथ साथ, हम एक तेजी से और परिष्कृत स्तंभ मुक्त CD11b चुंबकीय जुदाई प्रोटोकॉल (चित्रा 1) का प्रदर्शन। इस बेहतर विधि हमारे मूल स्तंभ से मुक्त विधि के रूप में के रूप में संभव रहता है के बाद से CD11b चुंबकीय जुदाई किट की कीमत एक ही है। पूरा होने के समय आधा है, जो सेल अस्तित्व और उपज को अधिकतम करने के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है में कम है। विशेष रूप से, पवित्रता इस अनुकूलित विधि से हासिल ~> 99%, पवित्रता मूल स्तंभ मुक्त हमारी प्रयोगशाला 15 द्वारा विकसित विधि से हासिल की पर एक उल्लेखनीय सुधार है। सबसे महत्वपूर्ण बात, CD11b-PEउपयोग नहीं किया जाता है, प्रकाश से दूर सेते की आवश्यकता को समाप्त और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए लाल चैनल के उपयोग की इजाजत दी। अन्त में, मूल CD11b विधि में के रूप में, उच्च उपज और पवित्रता का एक astrocytic अंश इस बेहतर विधि के साथ प्राप्त की है। Astrocytes, सीएनएस में सबसे अनेक glial कोशिकाओं रहे हैं विचार है कि उनके होमियोस्टैटिक कार्यों pathophysiology 18 के संबंध में अपरिहार्य हैं के लिए अग्रणी। इन glial कोशिकाओं में इस तरह के रक्त मस्तिष्क बाधा के गठन, पोषक तत्व सहायता प्रदान करने, न्यूरोट्रांसमीटर homeostasis को बनाए रखने, चोट, neuroprotection के जवाब में glial निशान बनाने, सीखने और स्मृति, और neuroinflammation, glial में उनकी जांच पड़ताल संभावित दृष्टांत मान विविध शारीरिक कार्यों में एक भूमिका निभा जीव विज्ञान 19। आकृति विज्ञान और microglia और astrocytes की कार्यक्षमता कोंफोकल माइक्रोस्कोपी, पश्चिमी सोख्ता, मात्रात्मक वास्तविक समय पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (QRT- पीसीआर), जी के माध्यम से पता लगाया गया हैरीस नाइट्राइट परख, और Luminex मल्टीप्लेक्स साइटोकाइन परख। इस प्रोटोकॉल द्वारा प्रदान की शोधन microglial या astrocytic शुद्धता, लाल चैनल की उपलब्धता के साथ प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के व्यापक आवेदन से संबंधित आत्मविश्वास में वृद्धि हुई है प्रदान करता है, और समय की बचत होती है, जो सभी इन विट्रो प्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
पुराने microglial अलगाव तरीकों सीमित वसूलियां कि उचित विभिन्न प्रोटीन के लिए पश्चिमी धब्बा द्वारा विश्लेषण करती है और शाही सेना QRT- पीसीआर द्वारा विश्लेषण नहीं हैं। अंतर पालन और हल्के trypsinization तरीकों कम microglial पै?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NS088206 और ES026892: इस काम के स्वास्थ्य (एनआईएच) के राष्ट्रीय संस्थानों अनुदान द्वारा समर्थित किया गया। डब्ल्यू यूजीन और लिंडा लॉयड संपन्न चेयर Agk करने और डीन प्रोफेसरशिप एके को भी स्वीकार किया जाता है।
Materials
| EasySep CD11b Separation Kit II | StemCell Technologies | 18970 | |
| EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| DMEM/F12 (1:1) (1x) | Life Technologies | 11330057 | |
| Sodium Pyruvate | Life Technologies | 11360070 | |
| MEM Non-essential amino acids (100x) | Life Technologies | 11140050 | |
| L-Glutamine (100x) | Life Technologies | 25030081 | |
| EDTA | Fisher Scientific | AM9260G | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | 13H469 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco by Life Technologies | 25200 | |
| Dulbecco's PBS | Gibco by Life Technologies | 14190250 |
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