蒸发减少培养条件的提高多细胞球体形成的微孔板重现
Summary
培养基从微量滴定板的凹凸损失影响均匀的多细胞肿瘤球体形成的再现性。改善培养条件，以减少显著介质损耗将提高球体形成的再现和基于球状体的测定的使用液体覆盖技术的结果。
Abstract
肿瘤模型， 在体内条件密切模仿正成为药物发现和开发的潜在的抗癌药物的筛选日益流行。多细胞肿瘤球状体（MCTSes）有效模仿实体瘤的生理条件下，使它们在体外模型优良铅优化和目标验证。从可供MCTS文化的各种技术，在琼脂糖液体覆盖法是对MCTS一代最便宜的方法之一。然而，使用液体的覆盖为高通量筛选MCTS培养物的可靠传输可能由许多限制，包括微量滴定板（MPS）琼脂糖的涂层并在井均匀MCTS地层的不可再现性受到损害。国会议员是显著容易发生边缘从培养基从板的外部过度蒸发造成的影响，防止药物使用整个板块的试验。这个手稿提供到液体覆盖技术来增加均匀MCTS形成的可扩展性和可重复性的详细技术的改进。此外，药物治疗提出后，对MCTS的评价简单，半自动，和普遍适用的软件工具的细节特征。
Introduction
在肿瘤癌细胞生理学布置在一个复杂的，三维（3D）细胞外基质和相互作用的细胞所包围的结构。作为近组织中的所有细胞驻留在3D环境中，有必要在该模拟肿瘤性状体外肿瘤模型更生理学相关导致的几个三维培养技术1，2，3的发展。这些模型正在成为基本的研究工具用于研究在三维2转移和细胞响应于治疗肿瘤微环境的作用。此外，相对于2维（2D）细胞培养物4，3D模型允许更好地了解肿瘤-基质的相互作用，从而影响细胞信号通路的。
的肿瘤细胞株多细胞肿瘤球状体（MCTSes）在三维细胞c的常用由于其相对接近体内肿瘤ulture车型。出的使用中的多种技术，MCTS代的琼脂糖包被的平板的液体覆盖技术（LOT）已经获得了铅的优化和靶标确认5，6，7，8，9，10，11显著兴趣。这是从最近的研究已成功能在使用LOT 6,7 MCTS文化运行化合物文库的导频屏幕明显。然而，由于介质的蒸发引起的不均匀损耗油井到井变异MCTS形态学和生长是伴随使用微量滴定板（MPS）的LOT常见障碍。因此，非均匀MCTSes形成危及意义和相关从药理学试验8，12，13的数据。除了再现性的问题，使用自动液体分配单元时影响基于LOT-高通量测定另一实际问题是在MP的涂布用琼脂糖。虽然分配单元可以保持加热，以防止琼脂糖的凝胶化，分配盒和管道的堵塞是机器人系统6的电位的关注。
为了克服这些挑战，我们最近在很多关于MCTS文化8设计了一些修改。这些修改主要是根据可能的方法来防止用户使用该工具在高通量筛查实验室中常见的国会议员中损失不均匀。修改后的很多跨3大小均匀，重现性MCTSes生成的详细过程84孔板（WPS）这里提出。手稿还提出了MCTS大小的评价半自动程序，特别是在不具有横截面面积的测量一个明确定义的边界部分破碎，药物处理MCTSes。
Protocol
Representative Results
Discussion
涂层384孔TC板用过滤琼脂糖
在很多的标准做法是使用1-1.5％低熔点琼脂糖涂覆板，这需要琼脂糖和/或分配单元也可以保持加热，以防止琼脂糖6的胶凝。琼脂糖的凝胶化是可能引起关注的，而使用具有小管的孔的范围直径在0.2和0.4之间的液体分配盒制备多块板。为了克服堵塞分配盒的潜在问题，0.75％的FAS被使用，因为它在分配期间不需要额外的加热。顺便说一?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是由来自教育，青年，体育和（LO1304）捷克外交部和捷克共和国的技术局（TE01020028）资助。笔者想感谢拉克什曼瓦拉纳西博士采取环保盖的静止图像。
Materials
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | Low-melting |
| McCOY's 5A Medium | Sigma-Aldrich | M8403 | |
| “rapid” Filtermax filter | TPP | 99505 | 0.22 μm, 500 mL |
| Multidrop™ Combi Reagent Dispenser | Thermo Fisher Scientific | 5840300 | |
| Small Tube Dispensing cassette | Thermo Fisher Scientific | 24073295 | Metal tip |
| 384-well TC plate | PerkinElmer | 6057308 | Plate type- CellCarrier |
| Standard Tube Dispensing Cassette | Thermo Fisher Scientific | 24072670 | |
| MicroClime Environmental Lid | Labcyte | LLS-0310 | |
| DMSO | Sigma | D4540 | |
| Rotary Incubator (SteriStore ) | HighRes Biosolutions | 23641 | Serial No.: D00384 |
| Microplate Washer Dispenser | BioTek | Unspecified | Model: EL406 |
| High-Content Imaging System (CellVoyager ) | Yokogawa Electric Corporation | Unspecified | Model: CV7000 |
| Orange G | New England Biolabs | B7022S | |
| TrypLE™ Express recombinant cell dissociation reagent | Thermo Fisher Scientific | 12604021 | Phenol red free |
References
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