Síntese de biocompatíveis cristal líquido de elastómero Espumas como andaimes celulares para cultura de células 3D espaciais

Summary

Este estudo apresenta uma metodologia para preparar 3D, andaimes, células do tipo espuma biodegradáveis ​​à base de elastómeros biocompatíveis cristal líquido de cadeia lateral (LCES). expericias de microscopia confocal demonstram que LCEs do tipo espuma para permitir a ligação de células, proliferação, e o alinhamento espontânea de mioblastos C2C12s.

Abstract

Aqui, nós apresentamos uma preparação passo-a-passo de um,, andaime célula semelhante a espuma biodegradáveis ​​3D. Estes suportes foram preparados por ligação cruzada bloco em estrela de co-polímeros caracterizam unidades de colesterol como grupos pendentes da cadeia lateral, resultando em esmética-A (SmA) elastómeros de cristais líquidos (LCES). andaimes do tipo espuma, preparados utilizando moldes de metal, apresentam microcanais interligados, tornando-as adequadas como suportes de cultura celular 3D. As propriedades combinadas da estrutura regular da espuma metica e do resultado elastómero num andaime célula 3D que promove a proliferação de células não só mais elevado em comparação com películas convencionais porosas de modelo, mas também uma melhor gestão de transporte de massa (isto é, nutrientes, gases, resíduos , etc). A natureza do molde de metal permite a manipulação fácil de formas de espuma (isto é, rolos ou películas) e para a preparação de andaimes de diferentes tamanhos de poros para diferentes estudos de células embora preservando a interconnected natureza porosa do molde. O processo de corrosão não afeta a química dos elastômeros, preservando a sua natureza biocompatível e biodegradável. Mostramos que essas LCEs esméticos, quando cultivadas por períodos de tempo extensos, permitem o estudo de construções de tecido clinicamente relevantes e complexos, promovendo o crescimento e proliferação de células.

Introduction

Existem vários exemplos de materiais sintéticos e biológicos biocompatíveis para aplicação em estudos de células e para a regeneração de tecidos com vista a fixação de células e proliferação de ^{1, 2, 3, 4, 5.} Tem havido alguns exemplos de materiais biocompativeis, conhecidos como elastómeros de cristais líquidos (LCES), que poderiam responder aos estímulos externos com anisotrópica molecular encomendar ^{6, 7.} LCEs são materiais estímulos-sensíveis que combinam as propriedades mecânicas e elásticas de elastómeros com a funcionalidade óptica e de ordenação molecular de cristais líquidos ^{8, 9.} LCEs pode sofrer alterações de forma, a deformação mecânica, o comportamento elástico, e propriedades ópticas, em resposta a STIM externosuli (isto é., calor, tensão, luz, etc) ^{10, 11, 12, 13, 14, 15, 16.} Estudos anteriores demonstraram que os cristais líquidos (LCS) pode detectar o crescimento e a orientação de células ^{4, 17.} É possível, então, assumir que LCEs podem ser adequados para aplicações biológica e medicamente relevantes, incluindo andaimes célula e alinhamento. Descrevemos previamente a preparação de filmes esméticos biocompatíveis, biodegradáveis, lançou-moldados, e LCES finas apresentando um "tipo Swiss-queijo" morfologia porosa ^{6, 18.} Nós também preparado LCEs biocompatíveis nemáticos com morfologia globular como suportes para o crescimento de células ¹⁹ <sup>, ^20. Nosso trabalho teve como objetivo ajustar as propriedades mecânicas dos materiais para coincidir com as do tecido de interesse ^21. Além disso, estes estudos focam a compreensão das interacções célula-elastómero, assim como resposta celular em que os elastómeros são sujeitos a estímulos externos.

Os principais desafios foram, em parte, para adaptar a porosidade das LCEs para permitir a fixação das células e a permeação através da matriz de elastómero e de uma melhor transferência de massa. A porosidade destes filmes finos ⁶ permitido para a permeação celular através da maior parte da matriz, mas nem todos os poros eram totalmente interligado ou tinham um tamanho mais regular (homogénea) poros. Em seguida, apresentou um relatório sobre biocompatíveis elastômeros LCE nemáticos com morfologias globulares. Estes elastómeros nemáticos permitido para a adesão e proliferação de células, mas o tamanho dos poros variou somente de 10-30 um, o qual impedido ou limitado a utilização desteselastómeros com uma ampla variedade de linhas de células ^{19, 20.}

Os trabalhos anteriores por Kung et ai. sobre a formação de espumas de grafeno usando um molde de metal "sacrificial" mostrou que a espuma grafeno obtido tinha uma morfologia porosa muito regular ditada pelo molde do metal escolhido ^22. Esta metodologia oferece controle total de porosidade e poros tamanho. Ao mesmo tempo, a maleabilidade e flexibilidade do molde do metal permitir a formação de molde diferentes formas antes da preparao da espuma. Outras técnicas, tais como lixiviação de material ^23, de templates ^de gás ^24, ou fibras fiadas electrodepositadas ^{25, 26} também oferecer o potencial para a preparação de materiais porosos, mas eles são mais demorado e, em alguns casos, o tamanho de poro está limitado a apenas alguns micrômetros. Espuma-como LCEs 3D preparadas utilizando moldes de metal permitir uma carga maior de células; uma taxa de proliferação melhorada; co-cultura; e, por último mas não menos importante, uma melhor gestão de transporte de massa (ou seja, nutrientes, gases e resíduos) para garantir o desenvolvimento do tecido completo ^27. LCEs 3D-espuma como também parece melhorar o alinhamento das células; esta é mais provável em relação aos pingentes LC detecção do crescimento celular e a orientação da célula. A presença de porções LC dentro do LCE parece aumentar o alinhamento das células no que diz respeito à localização de célula dentro do andaime LCE. Células alinhar dentro das escoras do LCE, enquanto nenhuma orientação clara é observada onde as escoras unir (cruzamentos) ^27.

No geral, a plataforma de andaime célula LCE de um meio de suporte de células oferece oportunidades para afinar a morfologia elastómero e propriedades elásticas e para dirigir especificamente o alinhamento de tipos de células (individuais) para criar uma forma ordenada, o arranjos espaciaiscélulas de f semelhantes aos sistemas vivos. Para além de proporcionar uma estrutura de suporte capaz de suportar e direccionar o crescimento celular a longo prazo e a proliferação, LCEs também permitir experiências dinâmico, onde a orientação das células e as interacções podem ser modificados em tempo real.

Protocol

NOTA: As etapas a seguir para a preparação do tipo espuma LCE 3D utilizando o copolímero em bloco em estrela 3-braço são mostrados na Figura 1. Para a caracterização de ressonância magnética nuclear (RMN), os espectros são registados em clorofórmio deuterado (CDCl3) à temperatura ambiente num instrumento Bruker DMX 400 MHz e internamente referenciadas picos residuais a 7,26. Transformação de Fourier espectro de infravermelho (FT-IV) são registados utilizando um Br…

Representative Results

Este relatório mostra o método de preparação de um LCE 3D poroso como um andaime para cultura de células utilizando um molde de metal de níquel. O 3D LCE obtido demonstra um complexa rede interligada canal que permite a infiltração de células fácil, bem como o transporte de massa mais adequado 27. Verificou-se que as células são capazes de penetrar completamente a rede de canais interligados e também é capaz de alinhar dentro do LCE. Aqui, uma espuma…

Discussion

elastómeros líquidos cristalinos têm sido recentemente estudada como andaimes de células biocompatíveis, devido à sua capacidade de resposta estímulos. Eles têm provado ser plataformas ideais como andaimes celulares. No entanto, um factor importante a ter em mente quando preparar e projetar um novo andaime LCE é a porosidade. A incorporação de sólidos lixiviáveis ²³ ou gases nem sempre resultar em porosidade homogénea ou poros totalmente interconectados. O uso de um modelo de metal …

Materials

1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyltriethoxysilane	Alfa Aesar	L16606	Silanizing agent
2-bis(4-hydroxy-cyclohexyl)propane	TCI	B0928	Reagent
2-chlorohexanone	Alfa Aesar	A18613	Reagent
2-heptanone	Sigma Aldrich	W254401	Solvent
2-propanol	Sigma Aldrich	278475	Solvent
3-chloroperbenzoic acid, m-CPBA	Sigma Aldrich	273031	Reagent
4-dimethylaminopyridine	Alfa Aesar	A13016	Reagent
4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI	Invitrogen	D1306	Nuclear Stain
5-hexynoic acid	Alfa Aesar	B25132-06	Reagent
Acetic acid	VWR	36289	Solvent
Acetone	Sigma Aldrich	34850	Solvent
Alcohol 200 proof ACS Grade	VWR	71001-866	Reagent
Benzene	Alfa Aesar	AA33290	Solvent
ε-caprolactone	Alfa Aesar	A10299-0E	Reagent
Chloroform	VWR	BDH1109	Solvent
Cholesterol	Sigma Aldrich	C8503	Reagent
Chromium(VI) oxide	Sigma Aldrich	232653	Reagent
Copper (I) iodide	Strem Chemicals	100211-060	Reagent
D,L-Lactide	Alfa Aesar	L09026	Reagent
Dichloromethane	Sigma Aldrich	320269	Solvent
Diethyl ether	Emd Millipore	EX0190	Solvent
N,N-Dimethylformamide	Sigma Aldrich	270547	Solvent
Dulbecco’s modified Eagle medium, DEME	CORNING Cellgo	10-013	Cell Media
Ethanol	Alfa Aesar	33361	Solvent
Formaldehyde	SIGMA Life Science	F8775	Fixative
Fetal bovine serum, FBS	HyClone	SH30071.01	Media Component
Filter paper, Grade 415, qualitative, crepe	VWR	28320	Filtration
Glycerol	Sigma Aldrich	G5516	Central node (3-arm)
Hexamethylene diisocyanate, HDI	Sigma Aldrich	52649	Crosslinker
Iron(III) chloride	Alfa Aesar	12357	Etching agent
Isopropyl alcohol	VWR	BDH1133	Solvent
Methanol	Alfa Aesar	L13255	Solvent
N,N'-dicyclohexylcarbodiimide	Aldrich	D80002	Solvent
N,N-Dimethylformamide	Sigma Aldrich	270547	Solvent
Nickel metal template	American Elements	Ni-860	Foam template
Neuroblastomas cells (SH-SY5Y)	ATCC	CRL-2266	Cell line
Penicillin streptomycin	Thermo SCIENTIFIC	15140122	Antibiotics
Polyethylene glycol 2000, PEG	Alfa Aesar	B22181	Reagent
Sodium azide	VWR	97064-646	Reagent
Sodium bicarbonate	AMRESCO	865	Drying salt
Sodium chloride	BDH	BDH9286	Drying salt
Sodium phosphate dibasic heptahydrate	Fisher Scientific	S-374	Drying salt
Sodium phosphate monobasic monohydrate	Sigma Aldrich	S9638	Drying salt
Sodium sulfate	Sigma Aldrich	239313	Drying salt
Tetrahydrofuran	Alfa Aesar	41819	Solvent
Thiosulfate de sodium	AMRESCO	393	Drying salt
Tin(II) 2-ethylhexanoate	Aldrich	S3252	Reagent
Toluene	Alfa Aesar	22903	Solvent
Triethylamine	Sigma Aldrich	471283	Reagent
Trypsin	HyClone	SH30042.01	Cell Detachment
Olympus FV1000