Synthese van biocompatibel Liquid Crystal elastomeerschuimen als Cell Stellingen voor 3D Ruimtelijke Cell Cultures
Summary
Deze studie geeft een methode voor 3D, bioafbreekbare, schuimachtige cellen steigers basis van biocompatibele zijketen vloeibaar kristal elastomeren (LCEs) te bereiden. Confocale microscopie experimenten tonen aan dat schuimachtige LCEs zorgen voor celhechting, proliferatie en de spontane uitlijning van C2C12s myoblasten.
Abstract
Hier presenteren we een stap-voor-stap de bereiding van een 3D, biologisch afbreekbaar, schuim-achtige cel schavot. Deze skeletten werden bereid door verknoping sterblok copolymeren met eenheden cholesterol zijketen zijgroepen waardoor smectische-A (SMA) met vloeibare kristallen elastomeren (LCEs). Foam-achtige steigers, bereid met behulp van metalen sjablonen, voorzien van onderling verbonden microkanalen, waardoor ze geschikt zijn als 3D-celkweek steigers. De gecombineerde eigenschappen van de vaste structuur van het metaalschuim en het elastomeer resulteren in een 3D cel scaffold dat niet alleen een hogere celproliferatie bevordert vergeleken met gebruikelijke poreuze matrijs films, maar ook een beter beheer van massatransport (dwz voedingsstoffen, gassen, afval etc.). De aard van de metalen matrijs zorgt voor eenvoudige manipulatie schuim vormen (dat wil zeggen, rollen of films) en voor de bereiding van steigers met verschillende poriegrootten voor verschillende celstudies behoud van de interconnectieted poreuze aard van de matrijs. Het etsproces tast de chemie van de elastomeren, behoud van hun biologisch verenigbaar en biologisch afbreekbaar. We tonen aan dat deze smectische LCEs, wanneer ze groeien voor een uitgebreide tijdsperioden, schakelt u de studie van klinisch relevante en complexe weefsel constructies terwijl het bevorderen van de groei en proliferatie van cellen.
Introduction
Er zijn verschillende voorbeelden van biologische en biocompatibele synthetische materialen bestemd voor gebruik in celstudies en weefselregeneratie gericht op celhechting en proliferatie 1, 2, 3, 4, 5. Er zijn enkele voorbeelden van biocompatibele materialen, bekend als vloeibare kristallen elastomeren (LCEs), die kunnen reageren op externe stimuli anisotrope moleculaire bestelling 6, 7 zijn. LCEs zijn stimuli-responsieve materialen die de mechanische en elastische eigenschappen van elastomeren combineren met de optische functionaliteit en moleculaire ordening vloeibaar kristal 8, 9. LCEs kunnen vormveranderingen, mechanische vervorming, elastisch gedrag en optische eigenschappen ervaren in reactie op externe stimuli (bijv., warmte, stress, licht, enz.) 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16. Eerdere studies hebben aangetoond dat vloeibare kristallen (LC) de groei en oriëntatie van cellen 4, 17 kan voelen. Men kan dan veronderstellen dat LCEs geschikt zijn voor biologisch en medisch relevante toepassingen, zoals mobiele steigers en uitlijning zijn. We hebben eerder beschreven de bereiding van smectische biocompatibel, biologisch afbreekbaar, gegoten gegoten en LCEs dunne film van een "type Zwitserse kaas" poreuze morfologie 6, 18. We bereidden ook nematisch biocompatibel LCEs met bolvormige morfologie als steigers voor celgroei 19 <sup>, 20. Ons werk was gericht op het afstemmen van de mechanische eigenschappen van de materialen aan die van het weefsel van belang 21 te passen. Ook zijn deze studies richten zich op het begrijpen van elastomeer-cel interacties, evenals cellulaire reactie wanneer de elastomeren, zijn aan externe stimuli.
De belangrijkste uitdagingen waren gedeeltelijk de porositeit van de LCEs om celhechting en permeatie door de elastomere matrix maat en beter massatransport. De porositeit van deze dunne films 6 liet cell permeatie door de massa van de matrix, maar niet alle poriën waren goed op elkaar en had een regelmatiger (homogene) poriegrootte. Vervolgens hebben we gemeld op biocompatibele nematisch LCE elastomeren met bolvormige morfologie. Deze nematische elastomeren toegestaan voor de hechting en proliferatie van cellen, maar de poriegrootte varieerde slechts 10-30 urn, die voorkomen of beperkt het gebruik van dezeelastomeren met een grotere verscheidenheid van cellijnen 19, 20.
Eerder werk van Kung et al. betreffende de vorming van grafeen schuimen onder gebruikmaking van een "sacrificial" metal template toonden dat de verkregen grafeen schuim had een vaste poreuze morfologie bepaald door de gekozen metalen matrijs 22. Deze methode biedt volledige controle van de porositeit en poriegrootte. Tegelijkertijd de buigzaamheid en de flexibiliteit van de metalen mal maken de vorming van verschillende template vóór schuimbereiding vormen. Andere technieken, zoals het materiaal uitlogen 23, gas templating 24 of elektro-gesponnen vezels 25, 26 bieden ook de mogelijkheid voor de vervaardiging van poreuze materialen, maar ze zijn tijdrovend en, in sommige gevallen, wordt de poriëngrootte beperkt tot slechts enkele micrometers. Schuim-achtige 3D LCEs bereid met metalen templates zorgen voor een hogere celbelasting; een verbeterde proliferatiesnelheid; co-kweken; en, last but not least, beter massatransport beheer (dat wil zeggen, voedingsstoffen, gassen en afval) tot volle ontwikkeling van weefsel 27 te waarborgen. Foam-achtige 3D LCEs lijken ook celuitlijning te verbeteren; Dit is waarschijnlijk ten opzichte van de LC hangers waarnemen celgroei en oriëntatie. De aanwezigheid van LC eenheden binnen het LCE lijkt celuitlijning verbeteren ten opzichte cellocatie in de LCE scaffold. Cellen uitlijnen binnen de stutten LCE, terwijl er geen duidelijke oriëntatie wordt waargenomen wanneer de stutten samen (knooppunten) 27 sluiten.
Algemeen is LCE cel scaffold platform als Celdrager medium biedt mogelijkheden voor het afstemmen het elastomeer morfologie en elastische eigenschappen en specifiek richten van de uitlijning (individueel) celtypen een geordende ruimtelijke arrangementen creëren of cellen vergelijkbaar met levende systemen. Naast het verschaffen van een scaffold staat is tot duurzame en richten langdurige celgroei en proliferatie, LCEs maken ook dynamische experimenten, waarbij celoriëntatie en interacties kunnen worden gewijzigd tijdens de vlucht.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vloeibaar kristallijne elastomeren zijn onlangs bestudeerd als biocompatibel cel steigers vanwege hun stimuli responsiviteit. Zij hebben bewezen dat ideaal platforms zoals mobiele steigers zijn. Echter, een belangrijke factor in gedachten te houden bij de voorbereiding van en het ontwerpen van een nieuwe LCE schavot is porositeit. De opname van uitloogbare vaste stoffen of gassen 23 niet altijd tot homogene poreusheid of volledig onderling verbonden poriën. Het gebruik van een metalen mal die ge…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag bedanken Kent State University (collaboratief onderzoek te verlenen en steun voor de Regenerative Medicine Initiative aan de Kent State – ReMedIKS) voor de financiële ondersteuning van dit project.
Materials
| 1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyltriethoxysilane | Alfa Aesar | L16606 | Silanizing agent |
| 2-bis(4-hydroxy-cyclohexyl)propane | TCI | B0928 | Reagent |
| 2-chlorohexanone | Alfa Aesar | A18613 | Reagent |
| 2-heptanone | Sigma Aldrich | W254401 | Solvent |
| 2-propanol | Sigma Aldrich | 278475 | Solvent |
| 3-chloroperbenzoic acid, m-CPBA | Sigma Aldrich | 273031 | Reagent |
| 4-dimethylaminopyridine | Alfa Aesar | A13016 | Reagent |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI | Invitrogen | D1306 | Nuclear Stain |
| 5-hexynoic acid | Alfa Aesar | B25132-06 | Reagent |
| Acetic acid | VWR | 36289 | Solvent |
| Acetone | Sigma Aldrich | 34850 | Solvent |
| Alcohol 200 proof ACS Grade | VWR | 71001-866 | Reagent |
| Benzene | Alfa Aesar | AA33290 | Solvent |
| ε-caprolactone | Alfa Aesar | A10299-0E | Reagent |
| Chloroform | VWR | BDH1109 | Solvent |
| Cholesterol | Sigma Aldrich | C8503 | Reagent |
| Chromium(VI) oxide | Sigma Aldrich | 232653 | Reagent |
| Copper (I) iodide | Strem Chemicals | 100211-060 | Reagent |
| D,L-Lactide | Alfa Aesar | L09026 | Reagent |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 320269 | Solvent |
| Diethyl ether | Emd Millipore | EX0190 | Solvent |
| N,N-Dimethylformamide | Sigma Aldrich | 270547 | Solvent |
| Dulbecco’s modified Eagle medium, DEME | CORNING Cellgo | 10-013 | Cell Media |
| Ethanol | Alfa Aesar | 33361 | Solvent |
| Formaldehyde | SIGMA Life Science | F8775 | Fixative |
| Fetal bovine serum, FBS | HyClone | SH30071.01 | Media Component |
| Filter paper, Grade 415, qualitative, crepe | VWR | 28320 | Filtration |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5516 | Central node (3-arm) |
| Hexamethylene diisocyanate, HDI | Sigma Aldrich | 52649 | Crosslinker |
| Iron(III) chloride | Alfa Aesar | 12357 | Etching agent |
| Isopropyl alcohol | VWR | BDH1133 | Solvent |
| Methanol | Alfa Aesar | L13255 | Solvent |
| N,N'-dicyclohexylcarbodiimide | Aldrich | D80002 | Solvent |
| N,N-Dimethylformamide | Sigma Aldrich | 270547 | Solvent |
| Nickel metal template | American Elements | Ni-860 | Foam template |
| Neuroblastomas cells (SH-SY5Y) | ATCC | CRL-2266 | Cell line |
| Penicillin streptomycin | Thermo SCIENTIFIC | 15140122 | Antibiotics |
| Polyethylene glycol 2000, PEG | Alfa Aesar | B22181 | Reagent |
| Sodium azide | VWR | 97064-646 | Reagent |
| Sodium bicarbonate | AMRESCO | 865 | Drying salt |
| Sodium chloride | BDH | BDH9286 | Drying salt |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Fisher Scientific | S-374 | Drying salt |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma Aldrich | S9638 | Drying salt |
| Sodium sulfate | Sigma Aldrich | 239313 | Drying salt |
| Tetrahydrofuran | Alfa Aesar | 41819 | Solvent |
| Thiosulfate de sodium | AMRESCO | 393 | Drying salt |
| Tin(II) 2-ethylhexanoate | Aldrich | S3252 | Reagent |
| Toluene | Alfa Aesar | 22903 | Solvent |
| Triethylamine | Sigma Aldrich | 471283 | Reagent |
| Trypsin | HyClone | SH30042.01 | Cell Detachment |
| Olympus FV1000 |
References
- Khor, E., Lim, L. Y. Implantable applications of chitin and chitosan. Biomaterials. 24 (13), 2339-2349 (2003).
- Chung, H. J., Park, T. G. Surface engineered and drug releasing pre-fabricated scaffolds for tissue engineering. Adv. Drug Deliv. Rev. 59 (4-5), 249-262 (2007).
- Yakacki, C. M., Gall, K. Shape-Memory Polymers for Biomedical Applications. Shape-Memory Polymers. 226, 147-175 (2010).
- Agrawal, A., et al. Stimuli-responsive liquid crystal elastomers for dynamic cell culture. J. of Mat. Res. 30 (4), 453-462 (2015).
- Agrawal, A., Yun, T. H., Pesek, S. L., Chapman, W. G., Verduzco, R. Shape-responsive liquid crystal elastomer bilayers. Soft Matter. 10 (9), 1411-1415 (2014).
- Sharma, A., et al. Biodegradable and Porous Liquid Crystal Elastomer Scaffolds for Spatial Cell Cultures. Macromol. Biosci. 15 (2), 200-214 (2015).
- Yakacki, C. M., et al. Tailorable and programmable liquid-crystalline elastomers using a two-stage thiol-acrylate reaction. RSC Adv. 5 (25), 18997-19001 (2015).
- deGennes, P. G., Hebert, M., Kant, R. Artificial muscles based on nematic gels. Macromolecular Symposia. 113, 39-49 (1997).
- Fleischmann, E. -. K., Zentel, R. Liquid-Crystalline Ordering as a Concept in Materials Science: From Semiconductors to Stimuli-Responsive Devices. Angew. Chem. Int. Ed. 52 (34), 8810-8827 (2013).
- Finkelmann, H., Kim, S. T., Munoz, A., Palffy-Muhoray, P., Taheri, B. Tunable mirrorless lasing in cholesteric liquid crystalline elastomers. Adv. Mater. 13 (14), 1069-1072 (2001).
- Artal, C., et al. SHG characterization of different polar materials obtained by in situ photopolymerization. Macromolecules. 34 (12), 4244-4255 (2001).
- Camacho-Lopez, M., Finkelmann, H., Palffy-Muhoray, P., Shelley, M. Fast liquid-crystal elastomer swims into the dark. Nat. Mater. 3 (5), 307-310 (2004).
- Yamada, M., et al. Photomobile polymer materials: Towards light-driven plastic motors. Angew. Chem. Int. Ed. 47 (27), 4986-4988 (2008).
- Ohm, C., Brehmer, M., Zentel, R. Liquid Crystalline Elastomers as Actuators and Sensors. Adv. Mater. 22 (31), 3366-3387 (2010).
- Fleischmann, E. -. K., et al. One-piece micropumps from liquid crystalline core-shell particles. Nat. Commun. 3, (2012).
- Herzer, N., et al. Printable Optical Sensors Based on H-Bonded Supramolecular Cholesteric Liquid Crystal Networks. J. Am. Chem. Soc. 134 (18), 7608-7611 (2012).
- Lockwood, N. A., et al. Thermotropic liquid crystals as substrates for imaging the reorganization of matrigel by human embryonic stem cells. Adv. Funct. Mater. 16 (5), 618-624 (2006).
- Sharma, A., et al. Effects of structural variations on the cellular response and mechanical properties of biocompatible, biodegradable, and porous smectic liquid crystal elastomers. Macromol. Biosci. , (2016).
- Bera, T., et al. Liquid Crystal Elastomer Microspheres as Three-Dimensional Cell Scaffolds Supporting the Attachment and Proliferation of Myoblasts. ACS Appl. Mater. Interfaces. 7 (26), 14528-14535 (2015).
- Bera, T., Malcuit, C., Clements, R. J., Hegmann, E. Role of Surfactant during Microemulsion Photopolymerization for the Creation of Three-Dimensional Liquid Crystal Elastomer Microsphere Spatial Cell Scaffolds. Front. Mater. 3 (31), (2016).
- McKee, C. T., Last, J. A., Russell, P., Murphy, C. J. Indentation Versus Tensile Measurements of Young’s Modulus for Soft Biological Tissues. Tissue Eng. Part B Rev. 17 (3), 155-164 (2011).
- Kung, C. -. C., et al. Preparation and characterization of three dimensional graphene foam supported platinum-ruthenium bimetallic nanocatalysts for hydrogen peroxide based electrochemical biosensors. Biosens. Bioelectron. 52, 1-7 (2014).
- Amsden, B. Curable, biodegradable elastomers: emerging biomaterials for drug delivery and tissue engineering. Soft Matter. 3 (11), 1335-1348 (2007).
- Sinturel, C., Vayer, M., Morris, M., Hillmyer, M. A. Solvent Vapor Annealing of Block Polymer Thin Films. Macromolecules. 46 (14), 5399-5415 (2013).
- Riboldi, S. A., et al. Skeletal myogenesis on highly orientated microfibrous polyesterurethane scaffolds. J. Biomed. Mater. Res. A. 84 (4), 1094-1101 (2008).
- Chung, S., Moghe, A. K., Montero, G. A., Kim, S. H., King, M. W. Nanofibrous scaffolds electrospun from elastomeric biodegradable poly(L-lactide-co-epsilon-caprolactone) copolymer. Biomed. Mater. 4 (1), 9 (2009).
- Gao, Y. X., et al. Biocompatible 3D Liquid Crystal Elastomer Cell Scaffolds and Foams with Primary and Secondary Porous Architecture. ACS Macro Lett. 5 (1), 14-19 (2016).
- Lenoir, S., et al. Ring-opening polymerization of alpha-chloro-is an element of-caprolactone and chemical modification of poly(alpha-chloro-is an element of-caprolactone) by atom transfer radical processes. Macromolecules. 37 (11), 4055-4061 (2004).
- Younes, H. M., Bravo-Grimaldo, E., Amsden, B. G. Synthesis, characterization and in vitro degradation of a biodegradable elastomer. Biomaterials. 25 (22), 5261-5269 (2004).
- Donaldson, T., Henderson, P. A., Achard, M. F., Imrie, C. T. Chiral liquid crystal tetramers. J. Mater. Chem. 21 (29), 10935-10941 (2011).
- Palmgren, R., Karlsson, S., Albertsson, A. C. Synthesis of degradable crosslinked polymers based on 1,5-dioxepan-2-one and crosslinker of bis-epsilon-caprolactone type. J. Pol. Sci. A Polym. Chem. 35 (9), 1635-1649 (1997).
