Synthese von biokompatiblen Liquid Crystal Elastomerschäume als Zellgerüste für 3D Spatial Zellkulturen

Summary

Diese Studie stellt eine Methode zur Herstellung von 3D, biologisch abbaubare, schaumartige Gerüste Zelle basierend auf biokompatible Seitenkettenflüssigkristall Elastomere (LCEs). Die konfokale Mikroskopie Experimente zeigen, dass schaumartige LCEs ermöglichen Zellanheftung, Proliferation und die spontane Ausrichtung der C2C12s Myoblasten.

Abstract

Hier präsentieren wir eine Schritt-für-Schritt Herstellung eines 3D, biologisch abbaubaren, schaumartige Zellgerüst. Diese Gerüste wurden hergestellt durch vernetzende Stern-Block-Copolymere mit Cholesterin-Einheiten als Seitenketten-Seitengruppen, die sich in der smektischen A (SmA) Flüssigkristall Elastomere (LCEs). Schaumartige Gerüste, hergestellt Metall Vorlagen verfügen miteinander verbundene Mikrokanäle, so dass sie geeignet als 3D-Zellkulturgerüste. Die kombinierten Eigenschaften der regelmäßigen Struktur des Metallschaums und des Elastomer Ergebnis in einem 3D – Zell Gerüst , das nicht nur eine höhere Zellproliferation im Vergleich zu herkömmlichen porösen Templat Filme, sondern auch eine bessere Verwaltung der Massentransport (dh Nährstoffe, Gase, Abfall fördert usw.). Die Art der Metallschablone ermöglicht die einfache Bearbeitung von Schaumformen (dh Rollen oder Folien) und zur Herstellung von Gerüsten unterschiedlicher Porengrößen für unterschiedliche Zellstudien unter Beibehaltung die interconnected poröse Natur der Vorlage. Der Ätzprozess wirkt sich nicht auf die Chemie der Elastomere, ihre biokompatibel und biologisch abbaubar Natur zu bewahren. Wir zeigen, dass diese smektische LCEs, wenn sie für ausgedehnte Zeiträume gewachsen, die Untersuchung von klinisch relevanten und komplexen Gewebekonstrukte ermöglichen, während das Wachstum und die Vermehrung von Zellen zu fördern.

Introduction

Es gibt mehrere Beispiele von biologischen und biologisch verträglichen synthetischen Materialien zur Anwendung , in Zellstudien und für die Geweberegeneration darauf abzielen, die Zellanheftung und Proliferation ^{1, 2, 3, 4, 5.} Es gibt einige Beispiele von biokompatiblen Materialien gewesen, bekannt als Flüssigkristall Elastomere (LCEs), die Molekular auf äußere Reize mit anisotropen reagieren könnten Bestellung ^{6, 7.} LCEs sind Stimuli reagierende Materialien , die die mechanischen und elastischen Eigenschaften von Elastomeren , die mit den optischen Funktionen und molekularen Anordnung von Flüssigkristallen ^{8, 9} verbinden. LCEs können Änderungen in der Form, mechanische Verformung, elastisches Verhalten auf, und die optischen Eigenschaften in Reaktion auf externe stimUli (dh., Wärme, Druck, Licht, etc.) ^{10, 11, 12, 13, 14, 15, 16.} Frühere Studien haben gezeigt , dass Flüssigkristallen (LCs) ⁴ , das Wachstum und die Orientierung von Zellen abtasten ^{kann, 17.} Es ist möglich, dann davon ausgehen, dass LCEs für biologisch und medizinisch relevante Anwendungen geeignet sein kann, einschließlich Zellgerüsten und Ausrichtung. Wir haben bereits berichtet , die Herstellung von smektischen biokompatibles, biologisch abbaubarem, gussgeformt, und dünnen Filme von LCEs einen „Swiss-Käse – Typ“ poröse Morphologie ^{6, 18.} Wir haben auch nematische biokompatiblen LCEs mit globuläre Morphologie als Gerüste für das Zellwachstum ¹⁹ hergestellt <sup> ^20. Unsere Arbeit wurde bei Abstimmung der mechanischen Eigenschaften der Materialien richtet ²¹ diejenigen des Gewebes von Interesse zu entsprechen. Außerdem konzentrieren sich diese Studien auf Elastomer-Zell-Wechselwirkungen zu verstehen, sowie zelluläre Reaktion, wenn die Elastomere auf äußere Reize unterliegen.

Die wichtigsten Herausforderungen waren teilweise die Porosität des LCEs maßzuschneidern für die Zellanheftung und Permeation durch die Elastomermatrix und zum besseren Massentransport zu ermöglichen. Die Porosität dieser Dünnschichten ⁶ für Zellpermeation durch die Masse der Matrix erlaubt, aber nicht alle Poren vollständig miteinander verbunden waren oder hatten ein regelmäßigeres (homogen) Größe Pore. Wir berichten dann auf biokompatiblen nematischen LCE Elastomere mit globulären Morphologien. Diese nematische Elastomere für die Anheftung und Proliferation von Zellen erlaubt, aber die Porengröße lag im Bereich von 10 bis 30 nur um, was verhindert, oder die Verwendung von dieser beschränktElastomere mit einer größeren Vielfalt von Zelllinien ^{19, 20.}

Frühere Arbeiten von Kung et al. im Zusammenhang mit der Bildung von Graphen Schäumen einer „Opfer“ Metallschablone zeigte , dass der erhaltene Graphitschaum eine sehr regelmäßige poröse Morphologie durch die gewählte Metallschablone ²² diktiert hatte. Diese Methode bietet die volle Kontrolle über die Porosität und Porengröße. Zur gleichen Zeit, die Geschmeidigkeit und Flexibilität der Metallschablone ermöglichen die Bildung von verschiedener Vorlage Schaumherstellung vor prägt. Andere Techniken, wie beispielsweise Material Auslaugung ^23, Gas Templat ²⁴ oder elektrogesponnenen Fasern ^{25, 26} bieten auch das Potential für die Herstellung von porösen Materialien, aber sie sind zeitaufwendig , und in einigen Fällen wird die Porengröße begrenzt auf nur wenige Mikrometer. Schaum-ähnlichen 3D LCEs vorbereitet Metallschablonen für eine höhere Zellenlast erlauben verwendet; eine verbesserte Proliferationsrate; Cokultivieren; und last but not least, eine bessere Massentransportmanagement (dh Nährstoffe, Gase und Abfall) , um sicherzustellen , vollständige Gewebeentwicklung ^27. Schaumartige 3D LCEs scheint auch Zellausrichtung zu verbessern; Dies ist wahrscheinlich in Bezug auf die LC-Anhänger Abfühlen Zellwachstum und die Zellorientierung. Die Anwesenheit von LC-Einheiten innerhalb des LCE erscheint Zellenausrichtung mit Bezug auf Zellenposition innerhalb des LCE Gerüstes zu verbessern. Zellen auszurichten innerhalb der Streben des LCE, während keine klare Orientierung beobachtet wird , wo die Verstrebungen miteinander verbinden (junctions) ^27.

Insgesamt ist unsere LCE Zellgerüstplattform als Zellträgermedium bietet die Möglichkeit zur Abstimmung der Elastomer Morphologie und elastische Eigenschaften und insbesondere die Ausrichtung der (individuellen) Zelltypen zu lenken, eine geordnete, räumlichen Anordnungen o zu schaffenf Zellen ähnlich wie lebende Systeme. Abgesehen von einem Gerüst der Lage erhalt Bereitstellung und langfristiges Zellwachstum und -proliferation zu leiten, LCEs erlaubt auch für dynamische Experimente, in denen Zellorientierung und Wechselwirkungen können im laufenden Betrieb geändert werden.

Protocol

HINWEIS: Die folgenden Schritte für die 3D LCE schaumartige Zubereitung des 3-armige Sternblockcopolymer verwendet , ist in Abbildung 1 dargestellt. Für Kernspinresonanz (NMR) Charakterisierung, die Spektren in deuteriertem Chloroform (CDCl 3) bei Raumtemperatur auf einem Bruker DMX – 400-MHz – Instrumente und intern referenzierten Restpeaks bei 7,26 aufgezeichnet. Fourier-Transformations-Infrarot (FT-IR) Spektren aufgenommen werden, einen Bruker Vector 33 FT-IR-Spektrometer u…

Representative Results

Dieser Bericht zeigt die Herstellungsverfahren eines porösen 3D LCE als Gerüst für die Zellkultur einer Nickel-Metall-Vorlage. Der erhaltene 3D LCE zeigt ein Komplex miteinander verbundenes Kanalnetzwerk , das ebenso wie weitere geeigneten Massentransport 27 für eine einfache Zellinfiltration ermöglicht. Es wurde festgestellt, dass die Zellen der Lage sind, in vollem Umfang das miteinander verbundene Kanalnetzwerk eindringen und ebenfalls innerhalb des LCE au…

Discussion

Flüssigkristalline Elastomere als biokompatible Zellgerüste untersucht aufgrund ihrer Reize Ansprechbarkeit kürzlich. Sie haben sich als ideale Plattformen als Zellgerüste sein. Jedoch ist ein wichtiger Faktor im Auge zu behalten bei der Vorbereitung und ein neues LCE Gerüstes Gestaltung ist Porosität. Die Einarbeitung von auslaugbaren Feststoffen oder Gas ²³ führt nicht immer in homogener Porosität oder vollständig miteinander verbundene Poren. Die Verwendung einer Metallschablone, die …

Materials

1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyltriethoxysilane	Alfa Aesar	L16606	Silanizing agent
2-bis(4-hydroxy-cyclohexyl)propane	TCI	B0928	Reagent
2-chlorohexanone	Alfa Aesar	A18613	Reagent
2-heptanone	Sigma Aldrich	W254401	Solvent
2-propanol	Sigma Aldrich	278475	Solvent
3-chloroperbenzoic acid, m-CPBA	Sigma Aldrich	273031	Reagent
4-dimethylaminopyridine	Alfa Aesar	A13016	Reagent
4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI	Invitrogen	D1306	Nuclear Stain
5-hexynoic acid	Alfa Aesar	B25132-06	Reagent
Acetic acid	VWR	36289	Solvent
Acetone	Sigma Aldrich	34850	Solvent
Alcohol 200 proof ACS Grade	VWR	71001-866	Reagent
Benzene	Alfa Aesar	AA33290	Solvent
ε-caprolactone	Alfa Aesar	A10299-0E	Reagent
Chloroform	VWR	BDH1109	Solvent
Cholesterol	Sigma Aldrich	C8503	Reagent
Chromium(VI) oxide	Sigma Aldrich	232653	Reagent
Copper (I) iodide	Strem Chemicals	100211-060	Reagent
D,L-Lactide	Alfa Aesar	L09026	Reagent
Dichloromethane	Sigma Aldrich	320269	Solvent
Diethyl ether	Emd Millipore	EX0190	Solvent
N,N-Dimethylformamide	Sigma Aldrich	270547	Solvent
Dulbecco’s modified Eagle medium, DEME	CORNING Cellgo	10-013	Cell Media
Ethanol	Alfa Aesar	33361	Solvent
Formaldehyde	SIGMA Life Science	F8775	Fixative
Fetal bovine serum, FBS	HyClone	SH30071.01	Media Component
Filter paper, Grade 415, qualitative, crepe	VWR	28320	Filtration
Glycerol	Sigma Aldrich	G5516	Central node (3-arm)
Hexamethylene diisocyanate, HDI	Sigma Aldrich	52649	Crosslinker
Iron(III) chloride	Alfa Aesar	12357	Etching agent
Isopropyl alcohol	VWR	BDH1133	Solvent
Methanol	Alfa Aesar	L13255	Solvent
N,N'-dicyclohexylcarbodiimide	Aldrich	D80002	Solvent
N,N-Dimethylformamide	Sigma Aldrich	270547	Solvent
Nickel metal template	American Elements	Ni-860	Foam template
Neuroblastomas cells (SH-SY5Y)	ATCC	CRL-2266	Cell line
Penicillin streptomycin	Thermo SCIENTIFIC	15140122	Antibiotics
Polyethylene glycol 2000, PEG	Alfa Aesar	B22181	Reagent
Sodium azide	VWR	97064-646	Reagent
Sodium bicarbonate	AMRESCO	865	Drying salt
Sodium chloride	BDH	BDH9286	Drying salt
Sodium phosphate dibasic heptahydrate	Fisher Scientific	S-374	Drying salt
Sodium phosphate monobasic monohydrate	Sigma Aldrich	S9638	Drying salt
Sodium sulfate	Sigma Aldrich	239313	Drying salt
Tetrahydrofuran	Alfa Aesar	41819	Solvent
Thiosulfate de sodium	AMRESCO	393	Drying salt
Tin(II) 2-ethylhexanoate	Aldrich	S3252	Reagent
Toluene	Alfa Aesar	22903	Solvent
Triethylamine	Sigma Aldrich	471283	Reagent
Trypsin	HyClone	SH30042.01	Cell Detachment
Olympus FV1000