Syntese av Biokompatible Liquid Crystal Elastomer Skum som Cell Stillas for 3D Spatial cellekulturer

Summary

Denne studien viser en metode for å fremstille 3D, biologisk nedbrytbare, skumlignende cellestillasene basert på biokompatible sidekjede flytende krystall-elastomerer (LCEs). Konfokalmikroskopi forsøk viser at skumlignende LCEs at cellene skulle feste, proliferasjon, og den spontane innretting av C2C12s myoblaster.

Abstract

Her presenterer vi en trinn-for-trinn fremstillingen av en 3D, bionedbrytbar, skumlignende celle stillaset. Disse stillaser ble fremstilt ved tverrbinding av stjerne-blokk-kopolymerer Med kolesterolheter som sidekjede utstikkende grupper, noe som resulterer i smektisk A-(SMA) med flytende krystall-elastomer (LCEs). Skumlignende stillaser, fremstilt ved anvendelse av metallrammer, har innbyrdes forbundne mikrokanaler, noe som gjør dem egnet som 3D-cellekultur stillaser. De kombinerte egenskapene til den vanlige struktur av metallskum og av elastomeren resultat i et 3D-celle stillas som fremmer ikke bare høyere celleproliferasjon sammenlignet med konvensjonelle porøse malbasert filmer, men også bedre styring av massetransport (dvs. næringsstoffer, gasser, avfalls , etc.). Naturen av metall malen gir en enkel manipulering av skum former (dvs. ruller eller filmer) og for fremstilling av stillaser med forskjellige porestørrelser for forskjellige cellestudier og samtidig bevare interconnected porøse natur av malen. Etseprosessen har ingen innvirkning på kjemien av elastomerene, bevare deres biokompatible og biologisk nedbrytbare natur. Vi viser at disse smektiske LCEs, når dyrket for omfattende tidsperioder, aktiverer studier av klinisk relevante og komplekse vev konstruerer mens fremme vekst og spredning av celler.

Introduction

Det er flere eksempler på biologiske og biokompatible syntetiske materialer beregnet for anvendelse i cellestudier og for vevsregenerering sikte på celleadhesjon og celleformering ^{1, 2, 3, 4, 5.} Det har vært noen få eksempler på biokompatible materialer, kjent som flytende krystall elastomerer (LCEs), som kan reagere på ytre stimuli med anisotropisk molekyl bestilling ^{6, 7.} LCEs er stimuli-responsive materialer som kombinerer mekaniske og elastiske egenskaper for elastomerer med optisk funksjonalitet og molekyl ordning av flytende krystaller ^{8, 9.} LCEs kan oppleve endringer i form, mekanisk deformasjon, elastisk oppførsel, og optiske egenskaper som respons på ytre stimuli (f.eks., varme, stress, lys, etc.) ^{10, 11, 12, 13, 14, 15, 16.} Tidligere studier har vist at flytende krystaller (LCS) kan ane vekst og orientering av celler ^{4, 17.} Det er mulig deretter å anta at LCEs kan være egnet for biologisk og medisinsk relevant applikasjoner, inkludert celle stillas og innretting. Vi har tidligere rapportert fremstillingen av smektiske biokompatible, bionedbrytbare, cast-formete, og tynne LCEs filmer med en "Swiss-ostetype" porøs morfologi ^{6, 18.} Vi har også fremstilt nematiske biokompatible LCEs med kuleformede morfologi som stillas for cellevekst ¹⁹ <sup> ^20. Vårt arbeid var rettet mot tuning de mekaniske egenskapene til materialer for å matche de av vevet av interesse ^21. Også disse studier fokuserer på å forstå elastomer-celleinteraksjoner, så vel som den cellulære reaksjonen når elastomerene er utsatt for eksterne stimuli.

De største utfordringene ble delvis å skreddersy porøsiteten til LCEs for å gi rom for cellebinding og gjennomtrengning gjennom det elastomere matrise og for bedre massetransport. Porøsiteten av disse tynne filmer ⁶ er tillatt for cellegjennomtrengning gjennom hoveddelen av matrisen, men ikke alle porer var fullstendig innbyrdes forbundet, eller hadde en mer vanlig (homogen) er porestørrelsen. Vi rapporterte på biokompatible nematiske LCE elastomerer med kule morfologi. Disse nematisk elastomerer er tillatt for festing og formering av celler, men porestørrelsen varierte bare 10-30 um, som hindret eller begrenset bruken av disseelastomerer med et bredere utvalg av cellelinjer ^{19, 20.}

Tidligere arbeid av Kung et al. i forbindelse med dannelsen av graphene skum ved anvendelse av en "offer" metall mal viste at det oppnådde graphene Skummet hadde en meget vanlig porøs morfologi bestemt av det valgte metall malen ^22. Denne metodikken gir full kontroll av porøsitet og pore størrelse. På samme tid, formbarhet og fleksibilitet av metallet malen muliggjøre dannelse av annen mal former før skumfremstilling. Andre teknikker, slik som materiale utvasking ^23, gass sjablonmiddel ^24, eller elektro-spunnet fiber ^{25, 26} har også potensialet for fremstilling av porøse materialer, men de er mer tidkrevende og, i noen tilfeller, er porestørrelsen begrenset til bare noen få mikrometer. skum-lignende 3D LCEs fremstilt ved anvendelse av metall-maler tillate en høyere celle belastning; en forbedret spredning hastighet; co-dyrkning; og, sist men ikke minst, bedre massetransport management (dvs. næringsstoffer, gasser og avfall) sikre full vev utvikling ^27. Skum-lignende 3D LCEs synes også å forbedre celle justering; Dette er mest sannsynlig i forhold til de LC anheng avføler cellevekst og celle orientering. Tilstedeværelsen av LC grupper innenfor LCE ser ut til å forbedre celle innretting med hensyn til celle sted inne i LCE stillaset. Celler justeres innenfor avstiverne av LCE, mens ingen klar orientering observeres hvor stiverne går sammen (kryss) ^27.

Samlet vår LCE celle stillasgulv som en celle-støttemedium gir muligheter for å justere elastomer morfologi og elastiske egenskaper og for spesifikt å styre innrettingen av (enkelt) celletyper for å skape en ordnet, romlige arrangementer of celler som ligner på levende systemer. Bortsett fra å tilveiebringe et stillas i stand til å støtte og lede langvarig cellevekst og proliferasjon, LCEs også tillate dynamiske eksperimenter, hvor cellen orientering og interaksjoner kan modifiseres på fly.

Protocol

MERK: Følgende trinn for 3D-LCE skumlignende preparat ved hjelp av tre-armet stjerne-blokk-kopolymer er vist i figur 1. For kjernemagnetisk resonans (NMR) karakterisering, er spektrene tatt opp i deuterert kloroform (CDCI3) ved romtemperatur på et Bruker DMX 400 MHz instrument og internt referert rest topper ved 7,26. Fourier transform infrarød (FT-IR) spektra ble registrert med en Bruker Vector 33 FT-IR spektrometer ved anvendelse av attenuert total reflektans. For hvert tri…

Representative Results

Denne rapporten viser fremgangsmåten for fremstilling av en porøs 3D LCE som et stillas for cellekultur ved anvendelse av en nikkel-metall-mal. Den oppnådde 3D LCE viser et komplekst sammenkoplet kanal nettverk som gir mulighet for enkel celleinfiltrasjon, så vel som mer egnet massetransporten 27. Det ble funnet at celler som er i stand til fullt ut trenge inn i det sammenkoplede kanalnettet og er også i stand til å justere innenfor LCE. Her, et metall nikke…

Discussion

Flytende krystallinske elastomerer har nylig blitt studert som biokompatible cellestillasene på grunn av deres reaksjonsevne stimuli. De har vist seg å være ideelle plattformer som celle stillaser. Men en viktig faktor å huske på når du forbereder og utforme en ny LCE stillaset er porøsitet. Inkorporeringen av utlutbare faststoffer ²³ eller gasser ikke alltid resulterer i homogen porøsitet eller fullstendig innbyrdes forbundet porer. Bruken av et metall mal som kan være etset seg ikke ba…

Materials

1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyltriethoxysilane	Alfa Aesar	L16606	Silanizing agent
2-bis(4-hydroxy-cyclohexyl)propane	TCI	B0928	Reagent
2-chlorohexanone	Alfa Aesar	A18613	Reagent
2-heptanone	Sigma Aldrich	W254401	Solvent
2-propanol	Sigma Aldrich	278475	Solvent
3-chloroperbenzoic acid, m-CPBA	Sigma Aldrich	273031	Reagent
4-dimethylaminopyridine	Alfa Aesar	A13016	Reagent
4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI	Invitrogen	D1306	Nuclear Stain
5-hexynoic acid	Alfa Aesar	B25132-06	Reagent
Acetic acid	VWR	36289	Solvent
Acetone	Sigma Aldrich	34850	Solvent
Alcohol 200 proof ACS Grade	VWR	71001-866	Reagent
Benzene	Alfa Aesar	AA33290	Solvent
ε-caprolactone	Alfa Aesar	A10299-0E	Reagent
Chloroform	VWR	BDH1109	Solvent
Cholesterol	Sigma Aldrich	C8503	Reagent
Chromium(VI) oxide	Sigma Aldrich	232653	Reagent
Copper (I) iodide	Strem Chemicals	100211-060	Reagent
D,L-Lactide	Alfa Aesar	L09026	Reagent
Dichloromethane	Sigma Aldrich	320269	Solvent
Diethyl ether	Emd Millipore	EX0190	Solvent
N,N-Dimethylformamide	Sigma Aldrich	270547	Solvent
Dulbecco’s modified Eagle medium, DEME	CORNING Cellgo	10-013	Cell Media
Ethanol	Alfa Aesar	33361	Solvent
Formaldehyde	SIGMA Life Science	F8775	Fixative
Fetal bovine serum, FBS	HyClone	SH30071.01	Media Component
Filter paper, Grade 415, qualitative, crepe	VWR	28320	Filtration
Glycerol	Sigma Aldrich	G5516	Central node (3-arm)
Hexamethylene diisocyanate, HDI	Sigma Aldrich	52649	Crosslinker
Iron(III) chloride	Alfa Aesar	12357	Etching agent
Isopropyl alcohol	VWR	BDH1133	Solvent
Methanol	Alfa Aesar	L13255	Solvent
N,N'-dicyclohexylcarbodiimide	Aldrich	D80002	Solvent
N,N-Dimethylformamide	Sigma Aldrich	270547	Solvent
Nickel metal template	American Elements	Ni-860	Foam template
Neuroblastomas cells (SH-SY5Y)	ATCC	CRL-2266	Cell line
Penicillin streptomycin	Thermo SCIENTIFIC	15140122	Antibiotics
Polyethylene glycol 2000, PEG	Alfa Aesar	B22181	Reagent
Sodium azide	VWR	97064-646	Reagent
Sodium bicarbonate	AMRESCO	865	Drying salt
Sodium chloride	BDH	BDH9286	Drying salt
Sodium phosphate dibasic heptahydrate	Fisher Scientific	S-374	Drying salt
Sodium phosphate monobasic monohydrate	Sigma Aldrich	S9638	Drying salt
Sodium sulfate	Sigma Aldrich	239313	Drying salt
Tetrahydrofuran	Alfa Aesar	41819	Solvent
Thiosulfate de sodium	AMRESCO	393	Drying salt
Tin(II) 2-ethylhexanoate	Aldrich	S3252	Reagent
Toluene	Alfa Aesar	22903	Solvent
Triethylamine	Sigma Aldrich	471283	Reagent
Trypsin	HyClone	SH30042.01	Cell Detachment
Olympus FV1000