Invasiv Opptreden av humane brystcancerceller i Embryonic Sebrafisk

Summary

Her beskriver vi xenograft sebrafisk modeller ved hjelp av to forskjellige injeksjonssteder, dvs. perivitelline plass og kanal av Cuvier, for å undersøke invasive atferd og å vurdere intravasation og bloduttredelse potensialet av menneskelige brystkreft celler, henholdsvis.

Abstract

I mange tilfeller trenger kreftpasienter dør ikke av en primær svulst, men snarere på grunn av metastaser. Selv om tallrike gnagermodeller er tilgjengelige for å studere cancer metastaser in vivo, er andre effektive, pålitelige, rimelige modeller som trengs for å få rask tilgang til potensielle virkninger av (epi) genetiske endringer eller farmakologiske forbindelser. Som sådan, illustrerer vi og forklare mulighetene for xenograftmodeller med humane brystkreftceller injiseres i sebrafisk embryo for å støtte dette målet. Under mikroskopet er fluorescerende proteiner eller kjemisk merkede humane brystcancerceller transplantert inn i transgene embryoer sebrafisk, Tg (FLI: EGFP), ved perivitelline plass eller kanal av Cuvier (DOC) 48 timer etter befruktning. Kort tid etter, er den tids romlige prosess av kreftcelle-invasjon, spredning, og metastase i den levende fiskelegemet visualisert under et fluorescerende mikroskop. Modellene bruker ulike injeksjonssteder, dvs. privitelline plass eller Doc er komplementære til hverandre, noe som reflekterer den tidlige fasen (intravasation trinn) og sent stadium (ekstravasasjon trinn) av det flertrinns metastatisk kaskade av hendelser. Videre kan peritumoral og intratumoral angiogenese observeres med innsprøyting i perivitelline plass. Hele forsøksperioden er ikke mer enn 8 dager. Disse to modellene kombinerer cellemerking, mikro-transplantasjon, og fluorescens bildeteknikker, slik at den hurtig evaluering av cancermetastase i respons til genetiske og farmakologiske manipulasjoner.

Introduction

Overt cancermetastase i klinikken omfatter en rekke kompliserte og flertrinns hendelser som er kjent som "metastatic cascade". Kaskade har blitt grundig gjennomgått og kan deles opp i påfølgende trinn: lokal invasjon, intravasation, formidling, arrest, bloduttredelser og kolonisering ^{1, 2.} En bedre forståelse av patogenesen av kreft-metastase og utvikling av mulige behandlingsstrategier in vivo krever robuste verts modeller av kreftcelle spredning. Gnagermodeller er godt etablert, og er mye brukt for å evaluere metastaser ^3, men disse metodene har lav virkningsgrad og etiske begrensninger, og er kostbare som en forkant modell for å bestemme hvorvidt en spesiell manipulasjon kan påvirke den metastatiske fenotype. Andre effektiv, pålitelig, lavkostmodeller er nødvendig for å få rask tilgang til potensielle virkninger av (epi) genetiske endringer eller Pharmacological forbindelser. På grunn av deres høye genetisk homologi til mennesker og gjennomsiktigheten av deres embryoer sebrafisk (Danio rerio) har oppstått som en viktig virveldyr modell og blir i økende grad anvendes i studiet av utviklingsprosesser, mikrobe-vert interaksjoner, menneskelige sykdommer, legemiddelscreening, etc . ^4. De kreft metastasemodeller som er etablert i sebrafisk kan gi et svar på manglene i gnagermodeller ^{5, 6.}

Selv om spontan neoplasi er knapt sett i vill sebrafisk ^7, er det flere langvarige teknikker for å indusere ønsket kreft hos sebrafisk. Carcinogen-induserte mutasjoner eller signalveien aktivering kan histologisk og molekylært modell karsinogenese, etterligne human sykdom i sebrafisk ^{7, 8, 9.} ved taking fordel av diverse forover og revers genetiske manipulasjoner av onkogener eller tumor-undertrykkere, (transgene) sebrafisk har også muliggjort potensielle studier av kreft dannelse og vedlikehold ^{6, 10.} De induserte kreft modellene i sebrafisk dekker et bredt spekter, inkludert fordøyelsesenzymer, reproduktive, blod, nervesystemet, og epitelial ^6.

Utnyttelsen av sebrafisk i kreftforskning har utvidet nylig på grunn av etableringen av humane tumorcelle xenograftmodeller i denne organisme. Dette ble først rapportert med menneske metastatisk melanom celler som ble vellykket innpodet i sebrafisk embryoer ved blastula scenen i 2005 ^11. Flere uavhengige laboratorier har bekreftet gjennomførbarheten av dette banebrytende arbeid ved å innføre et variert utvalg av pattedyrcancercellelinjer inn i zebrafisk på forskjellige steder og utviklingsstadier ^{5 <}/ Sup>. For eksempel, injeksjoner nær blastodisc og blastocyst av blastula trinnet; injeksjoner i plommesekken, perivitelline plass, kanal Cuvier (DOC), og bakre kardinalvene av 6-H- til 5 dager gamle embryoer; og injeksjoner i bukhulen til 30 dager gamle larver immunoundertrykket er utført ^{5, 12.} I tillegg allogene tumor transplantasjoner ble også rapportert i sebrafisk ^{12, 13.} En av de store fordelene ved bruk av transplantater er at det podede kreftceller kan være enkelt fluorescerende merket og skilles fra normale celler. Derfor undersøkelser av den dynamiske oppførsel av microtumor formasjonen ^14, celleinvasjon og metastase ^{15, 16, 17,} tumorindusert angiogenese ^{15, 1}8, og interaksjonene mellom kreftceller og vertsfaktorer ¹⁷ kan tydelig visualisert i den levende fiskekroppen, spesielt når transgene sebrafisk linjer er påført ^5.

Inspirert av den høye potensialet av sebrafisk xenograft-modeller for å evaluere metastase, demonstrerte vi at ende trans ekstravasasjon på egenskapene til ulike brystcancercellelinjer i halefinnen område av Tg (FLI: EGFP) sebrafisk embryoer gjennom Doc injeksjoner ^16. Rollen av transformerende vekstfaktor-β (TGF-β) ¹⁶ og benmorfogenetisk protein (BMP) ¹⁹ signalveier i pro- / anti-brystkreftcelleinvasjon og metastase ble også undersøkt i denne modell. Videre har vi også rekapitulert den intravasation egenskaper av mange forskjellige brystcancer cellelinjer i sirkulasjon ved hjelp av xenograft-modeller sebrafisk med perivitelline plass injeksjoner.

<p class = "jove_content"> Denne artikkelen viser detaljerte protokoller for sebrafisk xenograft-modell basert på injeksjon av humane brystcancerceller inn i det perivitelline plass eller Doc. Ved hjelp av høy-oppløsning fluorescensavbildning, viser vi den representative prosessen med intravasation inn i blodårer og invasiv oppførselen til forskjellige humane brystcancerceller, som beveger seg fra blodkarene inn i avaskulære tailfin området.

Protocol

All forskning ved hjelp av transgene fluorescerende sebrafisk Tg (FLI: EGFP) belastning, noe som har forbedret grønt fluoriserende protein (EGFP) -merket blodkar 20, inkludert boliger og eksperimenter ble utført i henhold til internasjonale retningslinjer og ble godkjent av den lokale Institutional komiteen for Animal Welfare (Dier Ethische Commissie (DEC) i Leiden University Medical Center. MERK: Som oppsummert i figur 1, er den protokoll grovt deles inn i fire trinn: embryoinnsam…

Representative Results

I den embryoniske xenograft modell sebrafisk med en perivitelline plass injeksjon, blir den hematogenous formidling av merkede kreftceller i fiskekroppen betraktet som aktiv migrasjon. Denne prosessen kan påvises og kvantifiseres under et fluorescerende mikroskop, som beskrevet i fremgangsmåtene ovenfor. For å illustrere dette xenograft modell, fulgte formidling prosessen med forskjellige brystcancer cellelinjer med kjent (eller uten) invasjon / metastasepotensiale i henhold …

Discussion

Her beskrev vi to metoder for å undersøke invasiv oppførsel av brystkreft celler i Tg (fli1: EGFP) sebrafisk embryo, med perivitelline plass og Doc injeksjoner. Ved å injisere kreftceller merket med kjemisk fargestoff eller fluorescerende protein i transgene embryoer sebrafisk, kan de dynamiske og romlige karakteristika for invasjon og metastase være klart spores i sanntid på enkelt-celle eller klynge nivået i tanken under et fluorescens mikroskop. I de fleste tilfeller er den raske utviklingen av metast…

Materials

Agarose	MP Biomedicals	AGAF0500
Borosilicate glass capillary	Harvard Apparatus	300038
Cholera enterotoxin	Calbiochem	227035
Confocal microscope	Leica	SP5 STED
DMEM-high glucose media containing L-glutamine	ThermoFisher Scientific	11965092
DMEM/F-12 media containing L-glutamine	ThermoFisher Scientific	21041025
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools Inc	11252-20
Epidermal growth factor	Merck Millipore	01-107
Fetal bovine serum	ThermoFisher Scientific	16140071
Fluorescent stereo microscope	Leica	M165 FC
HEK293T cell line	American Type Culture Collection	CRL-1573
Hydrocortisone	SigmaAldrich	227035
Horse serum	ThermoFisher Scientific	26050088
Insulin	SigmaAldrich	I-6634
MCF10A (M1) cell line			Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA)
MCF10Aras (M2) cell line			Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA)
MDA-MB-231 cell line	American Type Culture Collection	CRM-HTB-26
Manual micromanipulator	World Precision Instruments	M3301R
Micropipette puller	Sutter Instruments	P-97
Wide-tip Pasteur pipette (0,5-20 ul)	Eppendorf	F276456I
pCMV-VSVG plasmid			Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands)
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	ThermoFisher Scientific	15140122
PLV-mCherry plasmid	Addgene	36084
pMDLg-RRE (gag/pol) plasmid			Kindly provided by Prof. Dr. Rob Houben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands)
Pneumatic picoPump	World Precision Instruments	SYS-PV820
Polybrene	SigmaAldrich	107689
Prism 4 software	GraphPad Software
pRSV-REV plasmid			Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands)
Stereo microscope	Leica	MZ16FA
Tg (fli:EGFP) zebrafish strain			Kindly provided by Dr. Ewa Snaar-Jagalska (Institute of Biology, Leiden University, Leiden, The Netherlands)
Tris-base	SigmaAldrich	11814273001
Tricaine (3-aminobenzoic acid)	SigmaAldrich	A-5040
Trypsin-EDTA (0.5%)	ThermoFisher Scientific	15400054
Petri dishes, polystyrene (60 × 15 mm)	SigmaAldrich	P5481-500EA
Polystyrene dish with glass bottom	WillCo	GWST-5040