El comportamiento invasivo de las células del cáncer de mama humano en embriones de pez cebra
Summary
A continuación, describimos los modelos de pez cebra de xenoinjerto utilizando dos sitios de inyección diferentes, es decir, espacio perivitelino y el conducto de Cuvier, para investigar el comportamiento invasivo y para evaluar el potencial intravasación y la extravasación de células de cáncer de mama humano, respectivamente.
Abstract
En muchos casos, los pacientes con cáncer no mueren de un tumor primario, sino más bien debido a la metástasis. Aunque numerosos modelos de roedores están disponibles para el estudio de la metástasis del cáncer in vivo, se necesitan otros, modelos de bajo costo eficientes y fiables para acceder rápidamente a los efectos potenciales de (epi) cambios genéticos o compuestos farmacológicos. Como tal, ilustrar y explicar la viabilidad de modelos de xenoinjertos utilizando células de cáncer de mama humanas inyectadas en embriones de pez cebra para apoyar este objetivo. Bajo el microscopio, proteínas fluorescentes o células de cáncer de mama humano marcado químicamente se trasplantan en embriones de pez cebra transgénico, Tg (fli: EGFP), en el espacio perivitelino o conducto de Cuvier (Doc) 48 h después de la fertilización. Poco después, el proceso temporal-espacial de la invasión de células cancerosas, la difusión y la metástasis en el cuerpo de los peces que viven se visualizó en un microscopio fluorescente. Los modelos usando diferentes sitios de inyección, es decir, porespacio ivitelline o Doc son complementarios entre sí, lo que refleja la etapa temprana (etapa intravasación) y la etapa tardía (etapa extravasación) de la cascada metastásica de múltiples etapas de los acontecimientos. Por otra parte, la angiogénesis peritumoral y intratumoral se puede observar con la inyección en el espacio perivitelino. todo el período experimental no más de 8 días es. Estos dos modelos combinan el etiquetado celular, micro-trasplante, y las técnicas de imagen de fluorescencia, lo que permite la rápida evaluación de la metástasis del cáncer en respuesta a las manipulaciones genéticas y farmacológicas.
Introduction
metástasis del cáncer Overt en la clínica comprende una serie de eventos complejos y de múltiples pasos conocidos como la "cascada metastásica". La cascada ha sido extensamente revisada y puede ser diseccionada en etapas sucesivas: la invasión local, intravasación, la difusión, la detención, la extravasación y la colonización 1, 2. Una mejor comprensión de la patogénesis de la metástasis del cáncer y el desarrollo de estrategias potenciales de tratamiento in vivo requieren robustos modelos de acogida de la propagación de las células cancerosas. Modelos de roedores están bien establecidos y son ampliamente utilizados para evaluar la metástasis 3, pero estos enfoques tienen una baja eficacia y limitaciones éticas y son costosos como un modelo de vanguardia para determinar si una manipulación particular podría afectar el fenotipo metastásico. Se necesitan otros modelos eficientes, y de bajo costo confiable para acceder rápidamente a los posibles efectos de (epi) cambios genéticos o Pharmacologcompuestos iCal. Debido a su alta homología genética para los seres humanos y la transparencia de su embriones de pez cebra (Danio rerio) han surgido como un modelo vertebrado importante y se están aplicando cada vez más para el estudio de los procesos de desarrollo, interacciones microbio-huésped, enfermedades humanas, la detección de drogas, etc . 4. Los modelos de metástasis de cáncer establecidas en el pez cebra puede proporcionar una respuesta a las deficiencias de los modelos de roedores 5, 6.
Aunque neoplasia espontánea apenas se ve en el pez cebra salvaje 7, hay varias técnicas de larga data para inducir el cáncer deseada en el pez cebra. Mutaciones de genes inducidos por carcinógenos o señalización activación de la vía pueden histológicamente y modelo de carcinogénesis molecularmente, imitando la enfermedad humana en el pez cebra 7, 8, 9. por taking ventaja de diversa avance y retroceso manipulaciones genéticas de oncogenes o supresores tumorales, (transgénicos) pez cebra también han permitido estudios potenciales de la formación de cáncer y de mantenimiento 6, 10. Los modelos de cáncer inducidos en el pez cebra cubren un amplio espectro, incluyendo digestivo, reproductivo, sangre, sistema nervioso y epitelial 6.
La utilización del pez cebra en la investigación del cáncer se ha expandido recientemente debido a la creación de modelos de xenoinjertos de células tumorales humanas en este organismo. Esto fue informado primero con células de melanoma metastásicos humanos que fueron arraigado con éxito en embriones de pez cebra en la etapa de blástula en 2005 11. Varios laboratorios independientes han validado la viabilidad de este trabajo pionero mediante la introducción de una amplia gama de mamíferos líneas de células cancerosas en el pez cebra en diversos sitios y etapas de desarrollo 5 </ Sup>. Por ejemplo, las inyecciones de cerca el blastodisco y blastocisto de la blástula; inyecciones en el saco vitelino, el espacio perivitelino, conducto de Cuvier (Doc), y la vena cardinal posterior de 6-h- a los embriones 5 días de edad; y las inyecciones en la cavidad peritoneal de larvas inmunosuprimidos 30 días de edad, se han realizado 5, 12. Además, también se informó de trasplantes tumorales alogénicas en el pez cebra 12, 13. Una de las grandes ventajas del uso de xenoinjertos es que las células de cáncer de injertado pueden ser fácilmente marcadas fluorescentemente y se distinguen de las células normales. Por lo tanto, las investigaciones sobre los comportamientos dinámicos de formación microtumor 14, la invasión de células y la metástasis 15, 16, 17, la angiogénesis inducida por el tumor 15, 18, y las interacciones entre las células cancerosas y factores del huésped 17 puede visualizarse claramente en el cuerpo de pescado vivo, especialmente cuando se aplican líneas de pez cebra transgénico 5.
Inspirado por el alto potencial de modelos de xenoinjerto de pez cebra para evaluar la metástasis, hemos demostrado las propiedades de extravasación transvascular de diferentes líneas celulares de cáncer de mama en la zona tailfin de Tg (fli: EGFP) embriones de pez cebra a través de inyecciones Doc 16. El papel de factor de crecimiento transformante-β (TGF-β) proteína 16 y morfogenética ósea (BMP) 19 vías de señalización en la invasión de células del cáncer de pro- / anti-mama y la metástasis se investigó también en este modelo. Por otra parte, también recapitulado la capacidad intravasación de diversas líneas celulares de cáncer de mama en circulación utilizando modelos de pez cebra de xenoinjerto con inyecciones espacio perivitelino.
<p class = "jove_content"> Este artículo presenta los protocolos detallados para modelos de xenoinjertos de pez cebra en base a la inyección de células de cáncer de mama humano en el espacio perivitelino o Doc. El uso de imágenes de fluorescencia de alta resolución, se muestra el proceso de representante de intravasación en los vasos sanguíneos y el comportamiento invasivo de las diferentes células de cáncer de mama humano, que se mueven de los vasos sanguíneos en el área de tailfin avascular.Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, describimos dos métodos para investigar el comportamiento invasivo de las células de cáncer de mama en Tg (FLI1: EGFP) embriones de pez cebra, con el espacio perivitelino y Doc inyecciones. Mediante la inyección de células cancerosas marcadas con colorante químico o proteína fluorescente en embriones de pez cebra transgénico, las características dinámicas y espaciales de la invasión y la metástasis pueden ser claramente un seguimiento en tiempo real en el de una sola célula o nivel de clúst…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los estudios sobre miembros de la familia TGF-β son apoyados por el Centro de Genómica del Cáncer Países Bajos. Sijia Liu y Jiang Ren son apoyados por el Consejo de Becas de China durante 4 años de estudio en la Universidad de Leiden. Agradecemos al Dr. Fred Miller (Ann Instituto del Cáncer Karmanos Bárbara, Detroit, MI, EE.UU.) para las líneas de células MCF10A.
Materials
| Agarose | MP Biomedicals | AGAF0500 | |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus | 300038 | |
| Cholera enterotoxin | Calbiochem | 227035 | |
| Confocal microscope | Leica | SP5 STED | |
| DMEM-high glucose media containing L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| DMEM/F-12 media containing L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 21041025 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools Inc | 11252-20 | |
| Epidermal growth factor | Merck Millipore | 01-107 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 16140071 | |
| Fluorescent stereo microscope | Leica | M165 FC | |
| HEK293T cell line | American Type Culture Collection | CRL-1573 | |
| Hydrocortisone | SigmaAldrich | 227035 | |
| Horse serum | ThermoFisher Scientific | 26050088 | |
| Insulin | SigmaAldrich | I-6634 | |
| MCF10A (M1) cell line | Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA) | ||
| MCF10Aras (M2) cell line | Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA) | ||
| MDA-MB-231 cell line | American Type Culture Collection | CRM-HTB-26 | |
| Manual micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Wide-tip Pasteur pipette (0,5-20 ul) | Eppendorf | F276456I | |
| pCMV-VSVG plasmid | Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands) | ||
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| PLV-mCherry plasmid | Addgene | 36084 | |
| pMDLg-RRE (gag/pol) plasmid | Kindly provided by Prof. Dr. Rob Houben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands) | ||
| Pneumatic picoPump | World Precision Instruments | SYS-PV820 | |
| Polybrene | SigmaAldrich | 107689 | |
| Prism 4 software | GraphPad Software | ||
| pRSV-REV plasmid | Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands) | ||
| Stereo microscope | Leica | MZ16FA | |
| Tg (fli:EGFP) zebrafish strain | Kindly provided by Dr. Ewa Snaar-Jagalska (Institute of Biology, Leiden University, Leiden, The Netherlands) | ||
| Tris-base | SigmaAldrich | 11814273001 | |
| Tricaine (3-aminobenzoic acid) | SigmaAldrich | A-5040 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%) | ThermoFisher Scientific | 15400054 | |
| Petri dishes, polystyrene (60 × 15 mm) | SigmaAldrich | P5481-500EA | |
| Polystyrene dish with glass bottom | WillCo | GWST-5040 |
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