Summary

In vivo beeldvorming van transgene Gene Expression Individuele retinale voorouders in chimère zebravis embryo's to Cell Nonautonomous Invloeden Studie

Published: March 22, 2017
doi:

Summary

Live volgen van individuele WT retinale voorlopers in verschillende genetische achtergronden maakt voor de beoordeling van de bijdrage van de cel niet-zelfstandige signalering tijdens de neurogenese. Hier, een combinatie van gen knockdown, chimeer generatie via embryo transplantatie en in vivo time-lapse confocale beeldvorming werd gebruikt voor dit doel.

Abstract

De genetische en technische troeven hebben de zebravis gewervelde een belangrijk modelorganisme waarin de gevolgen van gen-manipulaties kunnen worden getraceerd in vivo gedurende de snelle ontwikkelingsperiode gemaakt. Meerdere processen kunnen worden onderzocht waaronder celproliferatie, genexpressie, celmigratie en morfogenese. Belangrijk, kan het genereren van chimeren door middel transplantaties gemakkelijk worden uitgevoerd, waardoor mozaïek etikettering en volgen van individuele cellen onder invloed van de nieuwe omgeving. Bijvoorbeeld, door het combineren functioneel gen manipulaties van de ontvangende embryo (bijvoorbeeld door micro-injectie morfolino) en levende beeldvorming, de effecten van extrinsieke signalen nonautonomous cellen (aangeleverd door de genetisch gemodificeerde milieu) individuele getransplanteerde donor cellen kan worden geëvalueerd. Hier laten we zien hoe deze aanpak wordt gebruikt om het begin van fluorescerende transgenexpressie vergelijken als proxy voor de timing die het lot determinatie in verschillende genetische host-omgevingen.

In dit artikel geven we het protocol voor microinjecting zebravis embryo's donorcellen te markeren en te-gen knock-down in gastheer embryo's, een beschrijving van de transplantatie techniek die wordt gebruikt om chimere embryo's te genereren, en het protocol voor de voorbereiding en uitvoering in vivo time-lapse confocale veroorzaken beeldvorming van meerdere embryo. Vooral uitvoeren op meerdere beeldvorming is cruciaal bij het vergelijken van de timing van gebeurtenissen zoals het ontstaan ​​van genexpressie. Dit vereist het verzamelen van gegevens uit meerdere controle en experimentele embryo's tegelijk verwerkt. Een dergelijke benadering kan eenvoudig worden uitgebreid voor onderzoek extrinsieke invloeden in een orgaan of weefsel van keuze toegankelijke imaging leven, mits transplantaties gemakkelijk kunnen worden gericht volgens de gevestigde embryonale lot kaarten.

Introduction

De mogelijkheid om belangrijke ontwikkelingsprocessen in een in vivo vertebrate visualiseren heeft bijgedragen dat de zebravis een belangrijk model voor de studie van normale en zieke omstandigheden (besproken in 1, 2). Vooral de neurale retina is een toegankelijk deel van het centrale zenuwstelsel. Het netvlies leent zich gemakkelijk studies van neurogenese voeren vanwege de goed georganiseerde, maar relatief eenvoudige structuur en zijn sterk geconserveerd neuron types in gewervelde species 3. Dynamiek van cellulaire gedrag zoals proliferatie, celcyclus exit asymmetrische celdeling, het lot specificatie, differentiatie en neurale vorming circuits kan het gehele proces van retinogenesis, die de centrale retina van de zebravis wordt aangevuld met 3 d postfertilization volgen ( dpf) 4, 5,ref "> 6, 7.

Bovendien kan de functionele eisen van verschillende genen in elk van de bovengenoemde stappen gelijktijdig worden beoordeeld in de zebravis netvlies, waardoor een voordeel boven andere vertebraat modellen waarin fenotypen uit de toepassing van gen knockout technieken kunnen alleen worden beoordeeld na autopsie van gefixeerde weefsels. Met name het gebruik van transgene lijnen waarin we visualiseren en controleren de expressie van fluorescerende eiwitten reporter transgenen in de retina, kunnen we tijdresolutie van genexpressie die het ontstaan ​​van een bepaald celtype neuronale grondslag verkrijgen. Door de snelle ontwikkeling van de zebravis, kunnen deze gebeurtenissen worden gevisualiseerd gedurende de gehele ontwikkelingsperiode, waardoor diepere inzichten in de temporele belang van genexpressie ten opzichte van neuronale cellen identiteitsverwerving en celgedrag.

Tenslotte kunnen deze benaderingen efficiënt gecombineerd in de zebravis met de productie van chimeer via transplantaties, waardoor inzicht in twee belangrijke aspecten van genfunctie. Ten eerste behandeling getransplanteerd van een donor embryo, waarin een bepaald gen werd neergeslagen terwijl zij ontwikkelen een ongelabeld wildtype milieu, kunnen we relevante informaties genfunctie in een cel-autonome wijze te verkrijgen. Dit leidt tot belangrijke inzichten over de functie van retinale lot bepalende factoren binnen de progenitorcellen zij worden doorgaans uitgedrukt in. Een voorbeeld hiervan is het onderzoek van de ontwikkeling lot resultaat van voorlopers die niet meer functioneel eiwit te genereren van deze genen 4, 6, 8, 9. Met behulp van deze aanpak, hebben we laten zien dat veel lot bepalende factoren (bijvoorbeeld Vsx1, Atoh7, Ptf1a, Barhl2) handelen cel-autonomously specifieke retinale neuronale lot te rijden; het ontbreken van genexpressie voornamelijk leidt tot een lot schakelaar, zodat de cellen met gen knockdown levensvatbare door eerst een alternatieve lot van de cel 4, 6, 7, 10 blijven. In de tweede plaats kan een dergelijke chimerische experimenten worden gebruikt om te beoordelen hoe wild type voorouders gedragen wanneer ze binnen de verschillende genetische omgevingen te ontwikkelen. Bijvoorbeeld door vergelijking van de ontwikkeling van WT cellen die gewoonlijk een gen van belang (en reporter transgen) in WT versus gemanipuleerde nieuwe omgeving (bijvoorbeeld gen knockout / knockdown) tot expressie, de daaruit voortvloeiende effecten op genexpressie en lot van de cel kan worden beoordeeld . Het ontbreken van bepaalde neuronen in de nieuwe omgeving, bijvoorbeeld, is aangetoond dat wild type voorlopercellen te beïnvloeden in een cel non-autonome wijze, om vertekening hen naar differentiatie in de ondervertegenwoordigd or ontbrekende neuron typen 4, 7, 11, 12. Gezien het feit dat het netvlies neuronen worden geboren in een geconserveerd histogenic bestelling door de opeenvolgend getimede expressie van specifieke neuronale lot determinant genen (lot genexpressie) (beoordeeld in 13), gebruikten we deze methoden om aan te tonen hoe de timing van het lot genexpressie in wild type voorlopers wordt beïnvloed wanneer dergelijke voorlopers ontwikkelen retinale hostomgevingen met geïnduceerde afwijkende cellulaire composities. Hier schetsen we deze benaderingen als bewijs voor hoe de combinatie van relatief standaard en meest gebruikte technieken maakt het onderzoek naar de timing van het lot genexpressie in de ontwikkeling van het netvlies voorouders 8, 9.

Dit protocol beschrijft een experimentele benadering combineren time-lapse imaging met het gemak van perhet vormen van transplantatie in de ex vivo ontwikkeling van de zebravis embryo individuele mosaically volgen gelabelde cellen gedurende de gehele periode van ontwikkelings retinogenesis. Door het uitvoeren van functionele gen manipulaties, hetzij in de gastheer embryo, donor embryo, beide of geen van beide, kan men de cel autonomie van gen-functie te beoordelen. Deze benadering kan wijd aangepast soortgelijke vraagstellingen in andere systemen waarvoor de afzonderlijke componenten hier beschreven geschikt.

Protocol

Alle procedures werden overeenkomstig de bepalingen van de Australische National Health en Medical Research Council gedragscode voor de verzorging en het gebruik van dieren uitgevoerd en werden goedgekeurd door de institutionele ethische comités. 1. Voorbereiding van de zebravis Volwassen vissen pairing Opgezet volwassen vissen als paren (of twee paren) in de juiste maat kweekbakken de avond vóór gebruik. Het vrouwelijke gescheiden van de mannelijke houden ge…

Representative Results

Dit werk geeft een experimentele protocol om veranderingen in genexpressie timing beoordelen wanneer wild type netvlies voorouders ontwikkelen binnen een morphant gastheer embryo. De experimentele gastheer embryo's Ptf1a morphants, die de tussenliggende geboren horizontale en amacrine interneuronen van het netvlies 7, 26 missen. Deze werden vergeleken gastheer embryo's die waren geïnjecteerd met een standaard controle mo…

Discussion

Inzicht in de mate waarin naburige cellen beïnvloeden timing van de expressie van cruciaal lot van de cel bepalend is essentieel als doel efficiënt instrueren embryonale of geïnduceerde multipotente stamcellen te differentiëren in een bepaalde post-mitotische celtype of weefsel patroon. Het bestuderen deze moleculaire gebeurtenissen in de ontwikkeling van cellen van de levende dieren verschaft bovendien relevante dynamische (temporele en ruimtelijke) gegevens over de specifieke cellulaire contexten gerelateerd aan d…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door een ARC DECRA aan PRJ (DE120101311) en door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) onderzoek subsidie ​​op LP (PO 1440 / 1-1). De Australische Regenerative Medicine Institute wordt ondersteund door fondsen van de staat regering van Victoria en de Australische federale regering. Wij erkennen Dr Jeremy Ng Chi Kei, die experimenten hier beschreven, zoals gepubliceerd in Kei et al uitgevoerd. , 2016. We zijn dankbaar voor de bepalingen van transgene vis uit Prof. Higashijima en dank Profs. Turner en Rupp voor de levering van de pCS2 + plasmide en Dr. Wilkinson voor het genereren van H2B-RFP en H2A-GFP constructen. Wij danken FishCore faciliteit personeel (Monash University) voor het verzorgen van onze dieren.

Materials

Agarose Bioline BIO-41025 Agarose coated dishes can be prepared a few days prior, sealed with parafilm to prevent drying and stored at 4C
Agarose low melt Sigma A9414-100G Can be prepared in larger volume, microwaved to liquify and then kept molte in 40C waterbath. 1 ml aliquots can be prepared (one for each group of embryos mounted).
borosillicate glass capillary tube w/o filament SDR Scientfic 30-0035 alternatives with similar diameter can be used 
borosillicate glass capillary tube with filament SDR Scientfic 30-0038 alternatives with similar diameter can be used 
glass petri dishes (60 mm diameter) Science Supply 1070506 any glass alternative of any size
Injection tube (2m) Eppendorf 524616004 This connects the needle holder to the syringe during transplantation
Microinjection mold (plastic mold with wedge-shaped protrusions) Adaptive Science Tools PT-1 alternatives with similar shape can be use
microneedle holder Narishige M-152 any alternative that fits the outside diameter of the injection needles can be used
microinjector Narishige or Eppendorf Femtojet Pneumatic injector using gas pressure
micromanipulator Coherent Scientific M330IR similar alternatives can be used
microloader tip Eppendorf 5242956003
Mineral oil Sigma M5904-500ML
needle puller Sutter Instruments Model P-2000 Settings used for this puller are: H 430, Fil 4, Vel 50, Del 225, Pul 75. Any needle puller can be used if it results in appropriate tip dimension
Parafilm Interpath PM996 any paraffin film
Pasteur pipette plastic Samco Scientific 202
Pasteur pipette glass Hirschmann Laborgeraete 9260101
Pronase Sigma P5942-25MG  Protease Type XIV
N-phenyl thiourea Sigma P7629-25G PTU is toxic and can be prepared as a stock solution to avoid frequent exposure to the powder, consult MSDS before purchase / use.
Qiaquick gel extraction Qiagen 28704 any alternatives to purify DNA can be used
Rneasy Mini kit Qiagen 74104 any alternatives to purify RNA can be used
SP6 mMessage kit Qiagen AM1340 any alternatives to transcribe DNA using SP6

References

  1. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).
  2. Scholpp, S., Poggi, L., Zigman, M. Brain on the stage – spotlight on nervous system development in zebrafish: EMBO practical course, KIT, Sept. 2013. Neural Dev. 8, 23 (2013).
  3. Cayouette, M., Poggi, L., Harris, W. A. Lineage in the vertebrate retina. Trends Neurosci. 29, 563-570 (2006).
  4. Poggi, L., Vitorino, M., Masai, I., Harris, W. A. Influences on neural lineage and mode of division in the zebrafish retina in vivo. J Cell Biol. 171, 991-999 (2005).
  5. Poggi, L., Zolessi, F. R., Harris, W. A. Time-lapse analysis of retinal differentiation. Curr Opin Cell Biol. 17, 676-681 (2005).
  6. Jusuf, P. R., et al. Biasing amacrine subtypes in the Atoh7 lineage through expression of Barhl2. J Neurosci. 32, 13929-13944 (2012).
  7. Jusuf, P. R., et al. Origin and determination of inhibitory cell lineages in the vertebrate retina. J Neurosci. 31, 2549-2562 (2011).
  8. Jusuf, P., Harris, W. A., Poggi, L. Imaging retinal progenitor lineages in developing zebrafish embryos. Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).
  9. Jusuf, P., Harris, W. A., Poggi, L. Preparation of transgenic zebrafish embryos for imaging the developing retina. Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).
  10. Vitorino, M., et al. Vsx2 in the zebrafish retina: restricted lineages through derepression. Neural Dev. 4, 14 (2009).
  11. Reh, T. A. Cell-specific regulation of neuronal production in the larval frog retina. J Neurosci. 7, 3317-3324 (1987).
  12. Reh, T. A., Tully, T. Regulation of tyrosine hydroxylase-containing amacrine cell number in larval frog retina. Dev Biol. 114, 463-469 (1986).
  13. Livesey, F. J., Cepko, C. L. Vertebrate neural cell-fate determination: lessons from the retina. Nature reviews. Neuroscience. 2, 109-118 (2001).
  14. Zolessi, F. R., Poggi, L., Wilkinson, C. J., Chien, C. B., Harris, W. A. Polarization and orientation of retinal ganglion cells in vivo. Neural Dev. 1, 2 (2006).
  15. Kimura, Y., Okamura, Y., Higashijima, S. alx, a zebrafish homolog of Chx10, marks ipsilateral descending excitatory interneurons that participate in the regulation of spinal locomotor circuits. J Neurosci. 26, 5684-5697 (2006).
  16. Kimura, Y., Satou, C., Higashijima, S. V2a and V2b neurons are generated by the final divisions of pair-producing progenitors in the zebrafish spinal cord. Development. 135, 3001-3005 (2008).
  17. Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , (2007).
  18. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
  19. Kei, J. N., Dudczig, S., Currie, P. D., Jusuf, P. R. Feedback from each retinal neuron population drives expression of subsequent fate determinant genes without influencing the cell cycle exit timing. J Comp Neurol. 524, 2553-2566 (2016).
  20. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J Vis Exp. , (2009).
  21. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. , (2009).
  22. Zou, J., Wei, X. Transplantation of GFP-expressing blastomeres for live imaging of retinal and brain development in chimeric zebrafish embryos. J Vis Exp. , (2010).
  23. Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. J Vis Exp. , (2009).
  24. Schier, A. F., Talbot, W. S. Molecular genetics of axis formation in zebrafish. Annu Rev Genet. 39, 561-613 (2005).
  25. De Luca, E., et al. ZebraBeat: a flexible platform for the analysis of the cardiac rate in zebrafish embryos. Sci Rep. 4, 4898 (2014).
  26. Lin, J. W., et al. Differential requirement for ptf1a in endocrine and exocrine lineages of developing zebrafish pancreas. Dev Biol. 274, 491-503 (2004).
  27. Hollyfield, J. G. Histogenesis of the retina in the killifish, Fundulus heteroclitus. J Comp Neurol. 144 (3), 373-380 (1972).
  28. La Vail, M. M., Rapaport, D. H., Rakic, P. Cytogenesis in the monkey retina. J Comp Neurol. 309 (1), 86-114 (1991).
  29. Rapaport, D. H., Wong, L. L., Wood, E. D., Yasumura, D., LaVail, M. M. Timing and topography of cell genesis in the rat retina. J Comp Neurol. 474 (2), 304-324 (2004).
  30. Sharma, S. C., Ungar, F. Histogenesis of the goldfish retina. J Comp Neurol. 191 (3), 373-382 (1980).
  31. Stiemke, M. M., Hollyfield, J. G. Cell birthdays in Xenopus laevis retina. Differentiation. 58 (3), 189-193 (1995).

Play Video

Citer Cet Article
Dudczig, S., Currie, P. D., Poggi, L., Jusuf, P. R. In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences. J. Vis. Exp. (121), e55490, doi:10.3791/55490 (2017).

View Video