Detectie van ligand-geactiveerde G-proteïne gekoppelde receptor internalisatie door confocale microscopie
Summary
Dit protocol beschrijft confocale microscopie detectie van G-eiwit-gekoppelde receptor (GPCR) internalisatie in zoogdiercellen. Het omvat de basis-celkweek, transfectie, en confocale microscopie procedure en zorgt voor een efficiënte en gemakkelijk te interpreteren methode om de subcellulaire lokalisatie en de internalisering van-fusion uitgedrukt GPCR detecteren.
Abstract
Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent fusion proteins, such as green fluorescent protein (GFP), to determine their expression, localization, and function. The subcellular localization of target proteins is important for identification, characterization, and functional analyses. Internalization is one of the predominant mechanisms controlling G protein-coupled receptor (GPCR) signaling to ensure the appropriate cellular responses to stimuli. Here, we describe an experimental method to detect the subcellular localization and internalization of GPCR in HEK293 cells with confocal microscopy. In addition, this experiment provides some details about cell culture and transfection. This protocol is compatible with a variety of widely available fluorescent markers and is applicable to the visualization of the subcellular localization of a majority of proteins, as well as of the internalization of GPCR. This technique should enable researchers to efficiently manipulate GPCR gene expression in mammalian cell lines and should facilitate studies on GPCR subcellular localization and internalization.
Introduction
Cellen bezitten lading handel machines te transporteren materialen extracellulaire-liganden zoals, micro-organismen, nutriënten en transmembraaneiwitten-in de cel informatie, energie en andere doelen 1, 2. Het is van cruciaal belang voor de cellulaire homeostase, de functie weefsel, en de algehele overleving cel. De cellen gebaseerde expressie van fluorescente fusieproteïnen is een krachtige manier om de lokalisatie en de internalisering van transmembraan receptoren zoals G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCR), studeren signaalroutes 3.
De expressie van fusie-eiwitten gelabeld met groen fluorescent eiwit (GFP) vanaf kwal Aequorea Victoria, gecombineerd met directe fluorescentie detectie technieken is algemeen geaccepteerd in proteïnerichtsignaalsequentie onderzoek 4, 5, 6. -GFP gebaseerde detectiOp heeft het voordeel dat de real-time beeldvorming van levende cellen met vermijding fixatie artefacten 7. Een reeks veelzijdige kloneringsvectoren is geconstrueerd om de expressie van eiwit fusies met GFP in verschillende cellen 8 te vergemakkelijken, 9. De pEGFP-N1 vector is een veel gebruikte en in de handel plasmidevector die codeert voor een versterkt groen fluorescent eiwit (EGFP), die is geoptimaliseerd van wildtype GFP voor helderdere fluorescentie en hogere expressie in zoogdiercellen. Waarnemen het fluorescentiesignaal van EGFP expressie in zoogdiercellen dient de fluorescentiemicroscopie verricht met excitatie bij 488 nm en emissie bij 507 nm, bij voorkeur met confocale microscopie.
Bewaken van de subcellulaire lokalisatie en ligand-gemedieerde internalisatie van receptoren is een gebruikelijke techniek om de signaaltransductie en functie van GPCRs 10 onderzoeken </sup>, 11. In de meeste gevallen leidt tot internalisatie desensitisatie van de GPCR (de verzwakking van de stimulusresponsie ondanks de aanwezigheid van agonisten) 12, 13. De geïnternaliseerde receptoren kunnen in het lysosoom worden opgenomen en afgebroken, of ze kunnen naar het celoppervlak worden gerecycleerd, afhankelijk van de aard van de receptoren en de cellijnen gebruikt in de experimenten.
Het gonadotropine afgevende hormoon receptoren (GnRHRs) behoren tot de GPCR-familie en een typische GPCR eiwitstructuur, met een extracellulair aminoterminaal, een intracellulaire -COOH terminal, zeven transmembraan (TM) domeinen 14. De transfectie van de recombinante plasmide Sj GnRHR-EGFP (met GnRHR gen uit Sepiella japonica) en confocale microscopie detectie van EGFP gelabeld Sj GnRHR (tot expressie gebracht in HEK293-cellen) gemeld Previously en GFP fluorescentie werd vastgesteld als een reporter voor transmembraan eiwit lokalisatie 15 assays. Nu, de internalisatie van Sj GnRHR, geactiveerd door S. japonica gonadotropine afgevende hormoon (GnRH Sj), werd aangetoond in tijd- en dosisafhankelijke manieren met confocale microscopie.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hier gepresenteerde protocol verschaft een efficiënte en eenvoudig te interpreteren methode om de subcellulaire lokalisatie en internalisatie van tot expressie gebracht GPCR fusie-eiwit in HEK293-cellen te detecteren. De techniek kan eenvoudig worden aangepast voor verschillende genen en celtypes, zoals de cellulaire lokalisatie en internalisatie van de receptor corazonin van Bombyx mori in HEK293 cellen 16 en BMN.
De succesvolle toepassing van deze krach…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors of this paper would like to thank Prof. Jiayan Xie for technical assistance and equipment usage. This work was financially supported by the National Natural Science Foundation of China (41406137).
Materials
| HEK293 cell line | |||
| DMEM/High glucose | Hyclone | SH30022.01 | High glucose 4.0 mM L-glutamine |
| Foetal Bovine Serum (FBS) | PuFei | 1101-100 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Genom | GNM10010 | |
| Penicillin-Streptomycin | Genom | GNM15140 | |
| 0.25% Trypsin & 0.02% EDTA | Genom | GNM25200 | |
| Opti-MEM (1X) | GIBCO, by Life Technologies | 31985-062 | reduced serum media |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668027 | Reagent 1 |
| X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent | Roche | 6366236001 | Reagent 2 |
| DAPI Staining Solution | Beyotime | C1006 | |
| DiI | Beyotime | C1036 | |
| Antifade Mounting Medium | Beyotime | P0126 | |
| Paraformaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent Co.(SCRC) | 80096618 | |
| 100 mm cell culture | CORNING | 430167 | |
| 6-well plate | ExCell Bio | CS016-0092 | |
| 12-well plate | ExCell Bio | CS016-0093 | |
| Cover Glass | NEST | 801007 | |
| Microscope Slides | Citoglas | 10127105P-G | |
| Thermo Scientific Forma CO2 Incubator | Thermo | 3111 | |
| TCS SP5II laser scanning confocal microscope | Leica | 5100001311 |
References
- Mellman, I. Endocytosis and molecular sorting. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12, 575-625 (1996).
- Hausott, B., Klimaschewski, L. Membrane turnover and receptor trafficking in regenerating axons. Eur J Neuro. 43, 309-317 (2016).
- Kallal, L., Benovic, J. L. Using green fluorescent proteins to study G-protein-coupled receptor localization and trafficking. Trends Pharmacol Sci. 21, 175-180 (2000).
- Prasher, D. C., Eckenrode, V. K., Ward, W. W., Prendergast, F. G., Cormier, M. J. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein. Gene. 111, 229-233 (1992).
- Spector, D. L., Goldman, R. D. Constructing and Expressing GFP Fusion Proteins. CSH protocols. 2006, (2006).
- Drew, D. E., von Heijne, G., Nordlund, P., de Gier, J. W. Green fluorescent protein as an indicator to monitor membrane protein overexpression in Escherichia coli. FEBS Lett. 507, 220-224 (2001).
- von Arnim, A. G., Deng, X. W., Stacey, M. G. Cloning vectors for the expression of green fluorescent protein fusion proteins in transgenic plants. Gene. 221, 35-43 (1998).
- Webb, C. D., Decatur, A., Teleman, A., Losick, R. Use of green fluorescent protein for visualization of cell-specific gene expression and subcellular protein localization during sporulation in Bacillus subtilis. J Bacteriol. 177, 5906-5911 (1995).
- Kain, S. R., et al. Green fluorescent protein as a reporter of gene expression and protein localization. BioTechniques. 19, 650-655 (1995).
- Fukunaga, S., Setoguchi, S., Hirasawa, A., Tsujimoto, G. Monitoring ligand-mediated internalization of G protein-coupled receptor as a novel pharmacological approach. Life Sci. 80, 17-23 (2006).
- Yang, J., et al. Agonist-Activated Bombyx Corazonin Receptor Is Internalized via an Arrestin-Dependent and Clathrin-Independent Pathway. Biochimie. 55, 3874-3887 (2016).
- Kohout, T. A., Lefkowitz, R. J. Regulation of G protein-coupled receptor kinases and arrestins during receptor desensitization. Mol Pharmacol. 63, 9-18 (2003).
- Ferguson, S. S., et al. Role of beta-arrestin in mediating agonist-promoted G protein-coupled receptor internalization. Science. 271, 363-366 (1996).
- Stojilkovic, S. S., Reinhart, J., Catt, K. J. Gonadotropin-releasing hormone receptors: structure and signal transduction pathways. Endocr Rev. 15, 462-499 (1994).
- Yan, Y. J., et al. Identification and Expression Profile of the Gonadotropin-Releasing Hormone Receptor in Common Chinese Cuttlefish, Sepiella japonica. J Exp Zool A Ecol Genet Physiol. , (2016).
- Yang, J., et al. Specific activation of the G protein-coupled receptor BNGR-A21 by the neuropeptide corazonin from the silkworm, Bombyx mori, dually couples to the G(q) and G(s) signaling cascades. J Biol Chem. 288, 11662-11675 (2013).
- Lu, Z. M., et al. Cloning, Characterization, and Expression Profile of Estrogen Receptor in Common Chinese Cuttlefish, Sepiella japonica. J Exp Zool A Ecol Genet Physiol. 325, 181-193 (2016).
