Обнаружение Лиганда-активированный G-белками рецепторы интернализации с помощью конфокальной микроскопии
Summary
Этот протокол описывает конфокальной микроскопии обнаружения G-белком рецепторов (GPCR) интернализации в клетках млекопитающих. Она включает в себя основную клеточной культуру, трансфекцию, и конфокальную микроскопию процедуру и обеспечивает эффективный и легко интерпретируемый метод для обнаружения внутриклеточной локализации и интернализаций слитого выразил GPCR.
Abstract
Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent fusion proteins, such as green fluorescent protein (GFP), to determine their expression, localization, and function. The subcellular localization of target proteins is important for identification, characterization, and functional analyses. Internalization is one of the predominant mechanisms controlling G protein-coupled receptor (GPCR) signaling to ensure the appropriate cellular responses to stimuli. Here, we describe an experimental method to detect the subcellular localization and internalization of GPCR in HEK293 cells with confocal microscopy. In addition, this experiment provides some details about cell culture and transfection. This protocol is compatible with a variety of widely available fluorescent markers and is applicable to the visualization of the subcellular localization of a majority of proteins, as well as of the internalization of GPCR. This technique should enable researchers to efficiently manipulate GPCR gene expression in mammalian cell lines and should facilitate studies on GPCR subcellular localization and internalization.
Introduction
Клетки обладают грузовой техникой оборота для транспортировки внеклеточного материалы, такой как лиганды, микроорганизмы, питательные вещества, и трансмембранные белки-в клетку для получения информации, энергии и других целей , 1, 2. Это имеет решающее значение для клеточного гомеостаза, функций тканей и общей выживаемости клеток. Экспрессии на основе клеток флуоресцирующих слитых белков является мощным средством для изучения локализации и интернализации трансмембранных рецепторов, таких как G-белком рецепторов (GPCR), в 3 сигнальных путей.
Экспрессии слитых белков , помеченные с зеленым флуоресцентным белком (GFP) из медузы Aequorea виктория, в сочетании с методами обнаружения прямой флуоресценции, получили широкое признание в белках-ориентации исследования 4, 5, 6. GFP основе detectiот того, имеет то преимущество , что позволяет в режиме реального времени обработки изображений живых клеток, избегая при фиксации артефактов 7. Серия универсальных векторов клонирования была построена , чтобы облегчить экспрессию слитых белков с GFP в различных клетках 8, 9. Вектор pEGFP-N1 является широко используемым и коммерчески плазмидный вектор, кодирующий усиленный зеленый флуоресцентный белок (EGFP), который был оптимизирован с дикого типа GFP для более яркой флуоресценции и более высокой экспрессии в клетках млекопитающих. Для наблюдения флуоресцентный сигнал EGFP, экспрессированный в клетках млекопитающих, то флуоресцентной микроскопии следует проводить с возбуждением на 488 нм и излучение на 507 нм, предпочтительно с конфокальной микроскопии.
Мониторинг внутриклеточной локализации и лиганд-опосредованная интернализации рецепторов является общим методом для исследования сигнальной трансдукции и функции GPCRs 10 </sвверх>, 11. В большинстве случаев, приводит к интернализации десенсибилизации из GPCRs (затухание реакции стимула, несмотря на присутствие агонистов) 12, 13. Интернализированные рецепторы могут быть включены в лизосомы и деградируют, или они могут быть переработаны обратно к клеточной поверхности, в зависимости от природы рецепторов и клеточных линий, используемых в экспериментах.
В гонадотропин-рилизинг гормона (рецепторы GnRHRs) принадлежат к семейству GPCR и имеют типичную структуру ХВГФ белка, с внеклеточным аминоокончанию, внутриклеточный -СООН терминала, и семь трансмембранных (ТМ) домены 14. Трансфекция рекомбинантной плазмиды Sj GnRHR-EGFP (с геномом GnRHR от Sepiella арошса) и конфокальная микроскопия Обнаружение EGFP-меченного Sj GnRHR (выраженной в клетках НЕК293) были сообщено Previouхитрое и флуоресценция GFP , была создана в качестве репортера трансмембранного белка локализации анализов 15. Теперь, интернализации Sj GnRHR, активированные С. японика гонадотропин-рилизинг гормон (ГнРГ Sj), была продемонстрированы в временных и дозозависимых способах с помощью конфокальной микроскопии.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол, представленный здесь, обеспечивает эффективный и легко интерпретируемый метод для обнаружения внутриклеточной локализации и интернализаций выраженного гибридного белка GPCR в клетках НЕК293. Методика может быть легко адаптирована для многих различных генов и типов клеток, та…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors of this paper would like to thank Prof. Jiayan Xie for technical assistance and equipment usage. This work was financially supported by the National Natural Science Foundation of China (41406137).
Materials
| HEK293 cell line | |||
| DMEM/High glucose | Hyclone | SH30022.01 | High glucose 4.0 mM L-glutamine |
| Foetal Bovine Serum (FBS) | PuFei | 1101-100 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Genom | GNM10010 | |
| Penicillin-Streptomycin | Genom | GNM15140 | |
| 0.25% Trypsin & 0.02% EDTA | Genom | GNM25200 | |
| Opti-MEM (1X) | GIBCO, by Life Technologies | 31985-062 | reduced serum media |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668027 | Reagent 1 |
| X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent | Roche | 6366236001 | Reagent 2 |
| DAPI Staining Solution | Beyotime | C1006 | |
| DiI | Beyotime | C1036 | |
| Antifade Mounting Medium | Beyotime | P0126 | |
| Paraformaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent Co.(SCRC) | 80096618 | |
| 100 mm cell culture | CORNING | 430167 | |
| 6-well plate | ExCell Bio | CS016-0092 | |
| 12-well plate | ExCell Bio | CS016-0093 | |
| Cover Glass | NEST | 801007 | |
| Microscope Slides | Citoglas | 10127105P-G | |
| Thermo Scientific Forma CO2 Incubator | Thermo | 3111 | |
| TCS SP5II laser scanning confocal microscope | Leica | 5100001311 |
References
- Mellman, I. Endocytosis and molecular sorting. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12, 575-625 (1996).
- Hausott, B., Klimaschewski, L. Membrane turnover and receptor trafficking in regenerating axons. Eur J Neuro. 43, 309-317 (2016).
- Kallal, L., Benovic, J. L. Using green fluorescent proteins to study G-protein-coupled receptor localization and trafficking. Trends Pharmacol Sci. 21, 175-180 (2000).
- Prasher, D. C., Eckenrode, V. K., Ward, W. W., Prendergast, F. G., Cormier, M. J. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein. Gene. 111, 229-233 (1992).
- Spector, D. L., Goldman, R. D. Constructing and Expressing GFP Fusion Proteins. CSH protocols. 2006, (2006).
- Drew, D. E., von Heijne, G., Nordlund, P., de Gier, J. W. Green fluorescent protein as an indicator to monitor membrane protein overexpression in Escherichia coli. FEBS Lett. 507, 220-224 (2001).
- von Arnim, A. G., Deng, X. W., Stacey, M. G. Cloning vectors for the expression of green fluorescent protein fusion proteins in transgenic plants. Gene. 221, 35-43 (1998).
- Webb, C. D., Decatur, A., Teleman, A., Losick, R. Use of green fluorescent protein for visualization of cell-specific gene expression and subcellular protein localization during sporulation in Bacillus subtilis. J Bacteriol. 177, 5906-5911 (1995).
- Kain, S. R., et al. Green fluorescent protein as a reporter of gene expression and protein localization. BioTechniques. 19, 650-655 (1995).
- Fukunaga, S., Setoguchi, S., Hirasawa, A., Tsujimoto, G. Monitoring ligand-mediated internalization of G protein-coupled receptor as a novel pharmacological approach. Life Sci. 80, 17-23 (2006).
- Yang, J., et al. Agonist-Activated Bombyx Corazonin Receptor Is Internalized via an Arrestin-Dependent and Clathrin-Independent Pathway. Biochimie. 55, 3874-3887 (2016).
- Kohout, T. A., Lefkowitz, R. J. Regulation of G protein-coupled receptor kinases and arrestins during receptor desensitization. Mol Pharmacol. 63, 9-18 (2003).
- Ferguson, S. S., et al. Role of beta-arrestin in mediating agonist-promoted G protein-coupled receptor internalization. Science. 271, 363-366 (1996).
- Stojilkovic, S. S., Reinhart, J., Catt, K. J. Gonadotropin-releasing hormone receptors: structure and signal transduction pathways. Endocr Rev. 15, 462-499 (1994).
- Yan, Y. J., et al. Identification and Expression Profile of the Gonadotropin-Releasing Hormone Receptor in Common Chinese Cuttlefish, Sepiella japonica. J Exp Zool A Ecol Genet Physiol. , (2016).
- Yang, J., et al. Specific activation of the G protein-coupled receptor BNGR-A21 by the neuropeptide corazonin from the silkworm, Bombyx mori, dually couples to the G(q) and G(s) signaling cascades. J Biol Chem. 288, 11662-11675 (2013).
- Lu, Z. M., et al. Cloning, Characterization, and Expression Profile of Estrogen Receptor in Common Chinese Cuttlefish, Sepiella japonica. J Exp Zool A Ecol Genet Physiol. 325, 181-193 (2016).
