Turbidimetrie Menschen Gewaschene Thrombozyten: Die Wirkung des Pannexin1-Inhibitor Brilliant Blue FCF auf Collagen-induzierte Aggregation
Summary
Wir beschreiben eine einfache Methode zur Isolierung von gewaschenen Thrombozyten aus menschlichem Blut, gefolgt von Agonisten induzierte Thrombozytenaggregation Messungen durch Turbidimetrie. Als Beispiel verwenden wir diese Methode zur Untersuchung der Aggregationsreaktion von menschlichen Blutplättchen an Kollagen nach einer Vorinkubation mit dem Pannexin1 Kanalinhibitor Brilliant Blue FCF.
Abstract
Turbidimetrie ist eine Labortechnik, die angewandt wird, um die Aggregation von Thrombozyten in entweder Plasma (platelet-rich plasma, PRP) oder in Puffern (gewaschenen Thrombozyten), durch die Verwendung von einer oder einer Kombination von Agonisten ausgesetzt zu messen. Die Verwendung von gewaschenen Plättchen aus ihrer Plasmaumgebung getrennt und in Abwesenheit von Antikoagulantien ermöglicht intrinsische Thrombozyten Eigenschaften zu studieren. Unter den großen Panel von Agonisten, Arachidonsäure (AA), Adenosin-di-phosphat (ADP), Thrombin und Kollagen sind die am häufigsten verwendet. Die Aggregationsreaktion wird durch Messung der relative optische Dichte (OD) über die Zeit der Thrombozytensuspension unter ständigem Rühren quantifiziert. Platelets in homogener Suspension begrenzt den Durchtritt von Licht nach der Zugabe eines Agonisten tritt Plättchenformänderung eine geringe vorübergehende Zunahme des OD erzeugen. Nach diesem anfänglichen Aktivierungsschritt, bildet allmählich Thrombozytenklumpen, die den Durchgang von Licht durch die Suspension als result verminderter OD. Der Aggregationsprozess wird schließlich als ein Prozentsatz ausgedrückt, verglichen mit dem OD-Wert von plättchenarmen Plasma oder Puffer. Rigorose Kalibrierung ist zu Beginn jeden Versuch somit unerlässlich. Als allgemeine Regel gilt: Kalibrierung auf 0% wird durch Messung der OD einer nicht-stimulierten Plättchensuspension eingestellt, während der OD des Suspensionsmediums Messung keine Blutplättchen enthalten, einen Wert von 100% entspricht. Die Thrombozytenaggregation wird als Echtzeit-Aggregationskurve allgemein sichtbar gemacht. Turbidimetrie ist eines der am häufigsten verwendeten Labortechniken zur Untersuchung der Thrombozytenfunktion und wird als der historische Goldstandard und für die Entwicklung neuer pharmazeutischer Wirkstoffe bei der Hemmung der Thrombozytenaggregation Ziel verwendet. Hier beschreiben wir ausführliche Protokolle für 1) Herstellung von humanen Thrombozyten gewaschen und 2) turbidimetrische Analyse von Kollagen-induzierter Aggregation von menschlichen gewaschenen Blutplättchen mit dem Lebensmittelfarbstoff Brilliant Blue FCF vorbehandelt, das vor kurzem war IdenFertigt als Inhibitor der Pannexin1 (Panx1) -Kanäle.
Introduction
Thrombozyten sind entscheidende Bestandteile des Blutes und ihre Hauptfunktion-zusammen mit Gerinnungsfaktoren-ist Blutungen nach der Blutgefäßverletzung zu stoppen. Thrombozyten sind klein (2-3 um) , kernlose Fragmente von Megakaryozyten des Knochenmarks abgeleitet 1. Platelets zirkuliert im nicht aktivierten Zustand, in dem sie erscheinen, als linsenförmige Strukturen. Bei Unterbrechung des Endothels, sammeln Blutplättchen an der Stelle der Blutgefäßverletzung um das Loch zu stecken, einen Prozess, die primäre Hämostase genannt. Anfänglich legen Plättchen zu subendothelialen Moleküle wie Kollagen und von – Willebrand – Faktor, dass 2 als Ergebnis der verletzungs Adhäsionsschritt ausgesetzt sind. Dann sie ihre Form verändern und chemischen Boten-Aktivierungsschritt absondern. Schließlich verbinden sie miteinander durch Rezeptoren-Aggregationsschritt überbrücken. Primäre Hämostase wird durch einen sekundären Prozess, der die Aktivierung der Gerinnungskaskade mit Fibrinablagerung, gefolgt, die Stabilisierungs die anfängliche Thrombus 2.
Akute ischämischen Ereignisse wie Herzinfarkt 3 führen oft von Thromben , die wegen körperlicher Störung (Bruch) ein atherosklerotischen Plaques bilden. Aktuelle Anti-Thrombozyten-Medikamente sind der Grundstein für die Behandlung dieser weit verbreiteten Krankheit, aber ihr klinischer Nutzen für Blutungen durch ein erhöhtes Risiko begrenzt. Die am meisten verschriebenen Arzneimittel in kardiovaskulären Patienten, Aspirin und anti-P2Y12 Verbindungen, zielen auf den Thromboxan – A2 und die ADP Bahnen 4 verbunden, die die Hauptwege , die zu Plättchenaktivierung sind. Allerdings innovative Forschung auf neue Ziele, die optimal antithrombotische Wirkung und hämorrhagisches Risiko ausgleichen würden, ist nach wie vor notwendig.
Von den 1960er Jahren 5 bis heute hat turbidimetrischen Aggregometrie eine entscheidende Rolle in der Forschung gespielt, unser Wissen über Plättchenreaktivität verbessern und in die Überwachung der Wirksamkeit von anti-thrombotischen Reagenzien beim Menschen. Turbidimetrie wurde zunächst extrahiert aus dem Blut zu PRP angewendet Proben. Tatsächlich Blutentnahme in Röhrchen durchgeführt, die eine schnelle und Citrat große Produktion von PRP erlaubt irgendeine Wirkung auf die Thrombozytenfunktion und Integrität ohne. Allerdings ist die Kurzzeitstabilität (ca. 3 h) von PRP und die verbleibenden plasmatische Enzyme, wie Thrombin, und die niedrige Calciumkonzentration im Zusammenhang mit potentiell artefactual Aggregationsprofilen sind von großem Nachteile für die Verwendung von PRP. Ein wichtiger Schritt ist die Entwicklung eines Verfahrens zur Thrombozytentrennung mit weiteren Zentrifugieren und Waschen wurden die Schritte 6. Kurz gesagt, ist PRP von Vollblut auf der Säure-Citrat-Dextrose (ACD) gesammelt wird, isoliert und Plättchen werden nach serieller Zentrifugationsschritte isoliert, bevor sie in ein iso-osmotischen Phosphatpuffern (Tyrode-Puffer), enthaltend Glucose, menschliches Serumalbumin und zweiwertigen C resuspendiertationen (Ca 2+ und Mg 2+). Um Änderungen in Plättchenreaktivität zu vermeiden, wird der pH-Wert von Tyrode-Puffer sorgfältig bei 7,35-7,4 gehalten. Darüber hinaus unerwünschte Aktivierung von Plättchen wird durch Zugabe von Prostacyclin (PGI 2) vor einiger Zentrifugationsschritte vermieden. Schließlich Zusatz von Apyrase verhindert gewaschenen Plättchen aus resistent gegen die Wirkung von ATP / ADP. Die resultierende Plättchensuspension fehlt Koagulationsmittel Faktoren und die Stabilität der Plättchen durch mindestens zweifach erhöht ist im Vergleich zu dem PRP-Lösungen. Darüber hinaus ist die Tatsache, dass Blutplättchen inaktiv aber intakt gewährleisten die Reproduzierbarkeit der turbidimetrischen Messungen sind, und bietet die Möglichkeit, die Wirkung von Agonisten oder Antagonisten von Blutplättchen-Aggregation in optimaler Weise zu studieren.
Unter Verwendung dieses Verfahrens haben wir in einer neuen Studie ergeben, dass durch einen genetischen Ansatz, um die Bildung von Kanälen Panx1 Hemmen (knock-out-Mäuse) oder Erniedrigen Panx1 Kanalaktivität durch pharmakologischeAnsätze reduziert Kollagen-induzierte Plättchenaggregation 7. Panx1 bildet ATP-Freisetzung Kanäle, die in vielen Zelltypen , einschließlich humanen Thrombozyten ubiquitär exprimiert werden 7, 8. In der Tat haben wir gezeigt , durch Turbidimetrie auf menschliche Blutplättchen , dass eine 7 min Vorinkubation mit einer Gruppe von mehr oder weniger spezifischen chemischen Blocker (Probenecid, Mefloquin und 10 Panx1 Peptide) vor der Zugabe verschiedenen Agonisten hemmte spezifisch gewaschenen kollageninduzierte Thrombozytenaggregation während Thrombozyten Reaktionen auf AA und ADP waren nicht betroffen. Wir zeigten, dass die ATP-Freisetzung durch Panx1 Kanälen interferiert speziell in der GPVI-Signalweg zu Kollagen-induzierte Aggregation führt. Interessanterweise beeinflussen mehrere FDA-zugelassene Verbindungen mit Anwendungen bei anderen Krankheiten (Probenecid, Mefloquin) die Aktivität von Panx1 Kanälen in Blutplättchen. Einerseits eröffnet diese neue therapeutische Perspektiven wählenively Plättchenreaktivität ändern. Auf der anderen Seite sollte man mögliche Nebenwirkungen dieser Verbindungen in Betracht ziehen. In diesem Zusammenhang verwendet die sichere Lebensmittel – Farbstoff Brilliant Blue FCF in mehreren Bonbons und Energy – Drinks ist als selektiver Inhibitor von Panx1 9 beschrieben. Wir beschreiben hier ein Protokoll für die Isolierung von humanen gewaschenen Plättchen und turbidimetrische Messungen der Plättchenaggregation geeignet ist, die Wirkung des Farbstoffs Brillantblau FCF als Antagonist der Plättchenaggregation zu untersuchen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es besteht eine großes Interesse neue Medikamente bei der Suche nach der Lage der Thrombozytenfunktion in der Reihenfolge der Modulation Thrombose ohne Erhöhung die Gefahr von Blutungen zu verhindern. Zu diesem Zweck werden in vitro Laboruntersuchungen , die zuverlässig und reproduzierbar Aggregationsreaktionen in menschlichen Blutplättchen sind absolut notwendig überwachen. Turbidimetrische Aggregometrie ist eine einfache Technik auszuführen. Allerdings müssen einige Vorsichtsmaßnahmen im Auge behalten…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem Schweizerischen Nationalfond (310030_162579 / 1 bis Brenda Renata Kwak und 320030_144150 zu Pierre Fontana) sowie durch einen Zuschuss von der Schweizerischen Herzstiftung unterstützt.
Materials
| citric acid monohydrate (C6H8O7*H2O) | Roth | 5949-29-1 | danger of eye damage/irritation |
| trisodium citrate dihydrate (Na3C6H5O7*2H2O) | Sigma-Aldrich | S1804 | – |
| D(+)-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | – |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | – |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | – |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6014 | – |
| Sodium dihydrogenophosphate monohydrate (NaH2PO4*H2O) | Sigma-Aldrich | S9638 | – |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2*6H2O) | Sigma-Aldrich | M9272 | – |
| Calcium chloride hexahydrate (CaCl2*6H2O) | Sigma-Aldrich | 442909 | danger of eye damage/irritation |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (Hepes) | ThermoFisher Scientific | 15630 | – |
| human serum albumin | CSL Behring | 00257/374 | – |
| hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 320331 | Corrosive and irritative for the respiratory system. Can cause severe skin and eye damages. |
| Eppendorf 5810 R | Fisher Scientific | – | – |
| heparin | Drosspharm AG/SA | 20810 | |
| prostacyclin I2 (PGI2) | Cayman | 18220 | – |
| apyrase from potatoes | Sigma-Aldrich | A6535 | – |
| fibrinogen (Haemocomplettan) | CSL Behring | HS 73466011 | – |
| thrombo-aggragometer SD-Medical | SD-Innovation | TA8V | – |
| Brilliant blue FCF (Erioglaucine disodium salt) | Sigma-Aldrich | 80717 | Harmful to aquatic life with long lasting effects (Avoid release to the environnement) |
| collagen | Horm, Nycomed | – | |
| arachidonic acid | Bio/Data corporation | C/N 101297 | – |
| cell counter Sysmex KX-21N | Sysmex Digitana | – | – |
| HEPES | Gibco | 15630-056 | – |
| glass cuvettes | SD-Innovation | THCV1000 | – |
| magnetic stirrers | SD-Innovation | THA100 | – |
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