誘導および定量化細胞老化するテクニック
Summary
細胞老化、細胞周期停止の不可逆的な状態は、様々な細胞ストレスによって誘導することができます。ここでは、老化のマーカーを評価するために、細胞の老化や方法を誘導するためにプロトコルを記述します。
Abstract
細胞ストレスやダメージを受けて、増殖細胞は、細胞の老化と呼ばれる長期的な細胞周期停止の状態を開始し、特定のプログラムを、誘導することができます。老化細胞の蓄積は、生物加齢とし、in vitroでの継続的な培養を介して行われます。老化細胞は、胚発生、組織修復及び再生、腫瘍抑制、および老化を含む多くの生物学的プロセスに影響を与えます。老化細胞の顕著な特徴としては、増加した老化関連βガラクトシダーゼ活性（SA-β-GAL）が、これらに限定されません。 p16 INK4A、p53及びp21レベル。 γ-H2AXを含むDNA損傷のより高いレベル、。老化関連ヘテロクロマチン病巣（SAHF）の形成。及び老化関連分泌表現型（SASP）、炎症性サイトカインおよびシグナル伝達分子の数の分泌によって特徴付けられる現象の取得。ここでは、我々は両方の複製のためのプロトコルを記述し、培養細胞におけるDNA損傷誘発性老化。加えて、我々は、SA-β-galを、γ-H2AXおよびSAHF染色を含むいくつかの老化関連マーカーを使用して老化表現型を監視するため、および細胞周期調節およびSASP因子のタンパク質およびmRNAレベルを定量するための技術を強調する。これらの方法には様々なモデルや組織における老化の評価に適用することができます。
Introduction
半世紀以上前に、ヘイフリックらは、培養液中で増殖する方法を非形質転換細胞述べたが、時間が1しか有限期間のため。ヒト線維芽細胞の長期培養は、細胞が増殖を停止させました。しかし、彼らは代謝的に活性であったが、これは細胞の老化と呼ばれていました。老化は、腫瘍形成を阻害するために有益であることができるが、老化2、3で発生再生能力の損失に寄与すると考えられているとしても、有害であることができます。老化細胞は、4歳の人間と胚発生、創傷治癒、組織修復、および年齢に関連した炎症2を含む生物学的プロセスの数に関与しているとして、組織に蓄積することが示されています。
培養中の細胞の継続的な継代は、リンクされている複製老化を誘導し、テロメア損耗とゲノム不安定性へ。 DNA損傷および癌遺伝子を含む種々の細胞ストレスも、老化3を引き起こす可能性があります。テロメア損耗以外の要因による老化は、多くの場合、ストレス誘導や早期老化と呼ばれ、一般のp16 INK4A / RB経路5に依存しています。増殖し、非形質転換細胞は、典型的には、形状のスピンドルに見えるが、老化細胞は、平坦な、大型形態および増加老化関連βガラクトシダーゼ活性（SA-β-GAL）（ 図1および2）を含む特定の特性を有するものとして同定することができます。老化細胞はまた、γ-H2AX（ 図3）6、及び、潜在的に、老化関連ヘテロ病巣（SAHF）（ 図4）7を含む、DNA損傷マーカーを蓄積します。老化細胞は、Pを含む細胞周期調節因子の高いレベルを持っています 16（P16 INK4A）および/またはp21およびp53の（ 図5）8、9。また、最近のデータは、老化細胞は、炎症性サイトカインおよびケモカインの数を分泌することによって、非自律的な効果を有し得ることを示した老化関連分泌表現型（SASP）10と呼ばれます。このSASP現象は、一般に、細胞型への細胞タイプによって異なる場合があるが、それはインターロイキン6（IL-6）の増加によって実証される、IL-8、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、増殖 – 調整された癌遺伝子α（GRO-α）、およびGRO-β、とりわけ（ 図6）。老化を誘導する特定のストレスまたは損傷はまた、分泌表現型11、12、13に影響を与え得ます。 SASPは、ELISA法またはサイトカイン/タンパク質アレイを用いて、分泌タンパク質のレベルを測定することによって検出することができますS = "外部参照"> 10、14。転写後機構がSASPタンパク質レベル11、15、16、17を調節することができるが、mRNAレベルの変化はまた、多くの場合に検出することができます。これらの変更は、一般的に、より敏感とタンパク質レベルの測定より定量化するのが容易です。他の老化マーカーはまた、永続的なDNA損傷核フォーカス、老化（DNA-SCARS）18補強クロマチン変化と呼ばれるDNAセグメント、および様々な他のマーカー3、19、20を含め、評価することができます。
ここでは、SA-β-Galを、γ-H2AX、SAHF、およびタンパク質および老化のmRNAを含む、培養中の細胞に老化を誘導し、また老化のいくつかのマーカーを測定するための一般的な技術を記述しますNCE関連分子。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、ヒト二倍体線維芽細胞を使用して複製し、DNA損傷誘発性老化のための方法を記載しています。加えて、種々の老化関連タンパク質のタンパク質およびmRNAレベルを定量するための技術が含まれ、ならびにSA-β-galのため及びDNA損傷マーカーγ-H2AXの染色します。多くの注意点は、インビボ 20 に老化を特徴付けるために存在するが、これらのプロトコルは?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、米国立衛生研究所の学内研究プログラム、アメリカ国立老化研究所によってサポートされていました。著者らはまた、批判的に原稿を読み取るための老化とKotb Abdelmohsenに関する多くの有用な議論のためにマイリアム・ゴロスプとKotb Abdelmohsenに感謝したいです。我々はまた、批判的に原稿を読み取るため、特にダグラス・ドルズン私たちの研究室のメンバーに感謝します。
Materials
| 16% Tris-glycine gels | Invitrogen | XP00160BOX | |
| Acid-Phenol ChCl3 | Ambion | AM9720 | |
| Alexa-Fluor 568 goat anti-mouse antibody | Invitrogen | A11031 | 1:300 dilution |
| Cell lifters | Corning Inc. | 3008 | Cell scraper |
| ECL anti-mouse HRP linked antibody | Amersham | NA931V | |
| ECL Plus Western Blotting Substrate | Pierce | 32132 | ECL |
| DAPI | Molecular Probes | MP01306 | stock 5 mg/ml in dH2O |
| GAPDH antibody | Santa Cruz | sc-32233 | 1:1,000-5,000 dilution |
| GlycoBlue | Ambion | AM9515 | |
| Histone H3 dimethyl K9 monoclonal antibody | Abcam | 1220 | 1:500 dilution |
| Human IL-6 Quantikine ELISA assay | R&D systems | D6050 | |
| Human IL-8 Quantikine ELISA assay | R&D systems | D8000C | |
| Human GROa Quantikine ELISA assay | R&D systems | DRG00 | |
| N-N-dimethylformamide | Sigma | D4551 | DMF |
| p16 monoclonal antibody | BD Biosciences | 51-1325gr | 1:500 dilution |
| p21 monoclonal antibody | Millipore | 05-345 | 1:750 dilution |
| p53 monoclonal antibody | Santa Cruz | sc-126 | 1:500 dilution clone DO-1 |
| phospho-H2AX (Ser139) FITC conjugate antibody | Cell Signaling | 9719 | 1:2000 dilution |
| POWER SYBR-green PCR master mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| Pre-stained molecular weight markers | Biorad | 161-0374 | |
| ProLong Gold Antifade | Invitrogen | P36930 | |
| PVDF membrane | Thermo Scientific | 88518 | |
| Senescence b-Galactosidase Staining Kit | Cell Signaling | 9860 | |
| TRIzol | Ambion/Life Tech | 10296028 | |
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