JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologie

Teknikler İndüklemek ve Ölçmek Hücresel Yaşlılık etmek

Published: May 01, 2017
doi:
10.3791/55533
,
1Laboratory of Epidemiology and Population Science,National Institute on Aging, National Institutes of Health

Summary

Hücresel yaşlanma, hücre döngüsü tutuklama tersinmez durum, çeşitli hücresel stresler tarafından indüklenebilir. Burada, yaşlanmanın işaretlerini değerlendirmek için hücre yaşlanmasının ve yöntemleri ikna etmek protokolleri açıklar.

Abstract

Hücresel stres veya hasara yanıt olarak, çoğalan hücrelerin hücresel yaşlanma olarak adlandırılan uzun süreli hücre siklüsü hapsi için bir durum başlatır belirli bir programı, neden olabilir. Yaşlanmış hücrelerin birikimi organizma yaşlanma ile ve in vitro olarak sürekli kültürleme yoluyla ortaya çıkar. Yaşlanan hücreler embriyonik gelişim, doku onarımı ve rejenerasyon, tümör bastırma ve yaşlanma gibi birçok biyolojik süreçleri, etkiler. yaşlanmış hücrelerin ayırt edici arasında, ancak, artan senesans ile ilişkili β-galaktosidaz aktivitesi (SA-β-gal) ile sınırlı değildir; p16 INK4a, p53 ve p21 seviyeleri; γ-H2AX dahil olmak üzere DNA hasarının daha yüksek seviyelerinin; Senesans ile ilişkili Heterokromatin odakları (SAHF) oluşması; ve bir senesans ile ilişkili Salgı fenotip (SASP), pro-enflamatuvar sitokinler ve sinyal molekülleri bir dizi salgılanması ile karakterize edilen bir fenomen kazanılması. Burada, hem replikatif için protokolleri tanımlamak veDNA, kültürlü hücrelerde yaşlanmayı hasar kaynaklı. Buna ek olarak, SA-β-gal, γ-H2AX ve SAHF boyama dahil olmak üzere birçok senesans ile ilişkili belirteçleri kullanarak yaşlanmış bir fenotipi izlemek, ve hücre döngüsü düzenleyicileri ve SASP faktörleri, protein ve mRNA seviyeleri ölçmek için teknikler vurgulamaktadır. Bu yöntemler, çeşitli model ve dokularında yaşlanmayı değerlendirilmesi için uygulanabilir.

Introduction

Yarım Üzeri asır önce, Hayflick ve arkadaşları kültürde çoğalmaya nasıl uğramamış hücreleri anlatılan ama zamanla 1'in yalnızca sınırlı bir süre için. İnsan fibroblast uzun süreli kültürleme çoğalan durdurmak için hücrelerin neden olduğu; ancak, metabolik olarak aktif olduğunu ve bu hücresel yaşlanma olarak adlandırıldı. Yaşlılık tümör oluşumunu inhibe etmek için yararlı olabilir, ama yaşlanma 2, 3 oluşur rejeneratif kapasitesinin kaybına katkıda bulunduğu düşünülmektedir olarak aynı zamanda, zararlı olabilir. Yaşlanmış hücreler Gı'de durdukları yaş 4 insanların ve embriyonik gelişme, yara iyileşmesi, doku tamiri, ve yaşla ilgili enflamasyon 2 de dahil olmak üzere biyolojik süreçler, bir dizi implike edilmiştir gibi dokularda birikebilir gösterilmiştir.

kültürdeki hücrelerin sürekli pasajı bağlanmıştır replikatif senesansın, indükleryıpratma ve genomik istikrarsızlık telomer. DNA hasarı ve onkogenler de dahil olmak üzere çeşitli hücre gerilimleri, aynı zamanda yaşlanmayı 3 neden olabilir. Telomer yıpratma dışındaki faktörlerden kaynaklanan Yaşlılık genellikle stres kaynaklı veya vaktinden evvel yaşlanmaya denilen ve genel olarak p16 INK4a / Rb yolu 5 bağlıdır. Çoğalan birlikte, transforme olmamış hücreler tipik olarak şekil mili görünür yaşlanmış hücreleri, bazı özelliklere sahip bir düz, büyük bir morfoloji ve artan senesans ile ilişkili β-galaktosidaz aktivitesi (SA-β-gal) (Şekil 1 ve 2) dahil olmak üzere tespit edilebilir. Yaşlanmış hücreler de γ-H2AX (Şekil 3), 6, ve muhtemelen, senesans ile ilişkili heterokromatin odakları (SAHF) (Şekil 4) 7 de dahil olmak üzere, DNA hasarı belirteçler birikir. Yaşlanmış hücreler p dahil olmak üzere hücre döngü düzenleyicileri ile ilgili daha yüksek seviyelerde sahip 16 (p16 INK4a) ve / veya p21 ve p53 (Şekil 5) 8, 9. Ayrıca, son veriler yaşlanmış hücrelerin, pro-inflamatuar sitokin ve kemokin, bir dizi salgılayarak otonom olmayan etkileri olduğu senesans ile ilişkili salgı fenotipi (SASP) 10 olarak adlandırılan göstermiştir. Bu SASP olgu, hücre türünden hücre türüne göre değişebilir, ancak genel olarak, bu İnterlökin-6 (IL-6) aksine, IL-8, granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF), büyümeyi bir artış ile ortaya konmuştur düzenlenmiş onkogen α (GRO-α) ve GRO-β, diğerleri arasında (Şekil 6). Yaşlanmayı indükleyen, özellikle stres veya hasar da salgı fenotipi 11, 12, 13 etkileyebilir. SASP ELISA'lar veya sitokin / protein dizileri kullanılarak salgılanan proteinlerin seviyelerini ölçerek tespit edilebilirs = "xref"> 10, 14. Transkripsiyon sonrası mekanizmalar SASP protein seviyeleri 11, düzenler, ancak 15, 16, 17, mRNA seviyelerinde değişiklikler de birçok durumda tespit edilebilir. Bu değişiklikler genellikle daha duyarlı ve protein seviyesi ölçümlerine göre ölçmek daha kolaydır. Diğer yaşlanmış belirteçler kalıcı DNA hasarı nükleer odaklar, yaşlanmayı (DNA izler) 18 takviye edici kromatin değişiklikler ile adlandırılan DNA bölümlerinin, ve çeşitli diğer belirteçler 3, 19, 20 dahil olmak üzere, saptanabilir.

Burada, SA-β-Gal, γ-H2AX, SAHF da dahil olmak üzere yaşlanma ait birçok belirteç, ölçülmesi için kültürdeki hücreler yaşlanmayı uyarılması ve ortak teknikleri tarif eder ve yaşlanmaya protein ve mRNAmoleküller nce ilişkili.

Protocol

1. Endükleyici Replikatif Senesens Çözülme düşük geçiş insan diploid fibroblastlar (örneğin, WI-38 ve IMR-90) ya da diğer hücre çizgileri dahildir. Not: Burada, insan diploid fibroblastlar kullanıldı, ancak bu protokoller, örneğin endotelyal, epitelyal veya mesenşimal kök hücreleri gibi diğer hücre tiplerinde, yaşlanmayı değerlendirmek için de kullanılabilir. Kültürleme koşulları nedeniyle farklı büyüme oranları veya büyüme koşullarına kullanılan farkl?…

Representative Results

, 6 SA-β-gal ile boyama temsil edici sonuçlar göstermektedir – 2 Şekil γ-H2AX ve SAHF için boyama; p16 INK4a, p21 ve p53 protein seviyelerinin değerlendirilmesi; ve mRNA ve yaşlanmış ilişkili moleküllerin protein seviyeleri. Artan SA-β-gal boyaması replikatif ve DNA hasarı ile indüklenen yaşlanma ile ortaya çıkar. Ayrıca, yaşlanma ile ortaya morfolojik değişikliklerini izleyin. Hücreler, çoğalan fibroblastların mil g…

Discussion

Burada, insan diploid fibroblastlarının kullanılarak replikatif ve DNA hasarına neden olduğu yaşlanma için yöntemler tarif etmişlerdir. Buna ek olarak, protein ve çeşitli senesans ile ilişkili proteinlerin mRNA seviyelerini ölçmek için teknikler, aynı zamanda boyama SA-β-gal ve DNA hasarına işaret γ-H2AX için edilmektedir. Birçok nokta vivo 20 yaşlanmayı karakterize etmek için mevcut olmakla beraber bu protokoller yaygın in vitro ve in vivo…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri İntramural Araştırma Programı, Ulusal Yaşlanma Enstitüsü tarafından desteklenmiştir. Yazarlar ayrıca eleştirel el yazması okumak için yaşlanma ve kotb Abdelmohsen ilgili birçok yararlı tartışmalar için Myriam Gorospe ve kotb Abdelmohsen teşekkür etmek istiyorum. Biz de eleştirel el yazması okumak için, özellikle Douglas Dluzen bizim laboratuvar üyelerine teşekkür.

Materials

16% Tris-glycine gels Invitrogen XP00160BOX
Acid-Phenol ChCl3 Ambion AM9720
Alexa-Fluor 568 goat anti-mouse antibody Invitrogen A11031 1:300 dilution
Cell lifters Corning Inc. 3008 Cell scraper
ECL anti-mouse HRP linked antibody Amersham NA931V
ECL Plus Western Blotting Substrate Pierce 32132 ECL
DAPI Molecular Probes MP01306 stock 5 mg/ml in dH2O
GAPDH antibody Santa Cruz sc-32233 1:1,000-5,000 dilution
GlycoBlue Ambion AM9515
Histone H3 dimethyl K9 monoclonal antibody Abcam 1220 1:500 dilution
Human IL-6 Quantikine ELISA assay R&D systems D6050
Human IL-8 Quantikine ELISA assay R&D systems D8000C
Human GROa Quantikine ELISA assay R&D systems DRG00
N-N-dimethylformamide  Sigma D4551 DMF
p16 monoclonal antibody BD Biosciences 51-1325gr 1:500 dilution
p21 monoclonal antibody Millipore 05-345 1:750 dilution
p53 monoclonal antibody Santa Cruz sc-126 1:500 dilution clone DO-1
phospho-H2AX (Ser139) FITC conjugate antibody Cell Signaling 9719 1:2000 dilution
POWER SYBR-green PCR master mix  Applied Biosystems 4367659
Pre-stained molecular weight markers Biorad 161-0374
ProLong Gold Antifade  Invitrogen P36930
PVDF membrane  Thermo Scientific 88518
Senescence b-Galactosidase Staining Kit Cell Signaling 9860
TRIzol Ambion/Life Tech 10296028
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hayflick, L. The Limited in Vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains. Exp Cell Res. 37, 614-636 (1965).
  2. van Deursen, J. M. The role of senescent cells in ageing. Nature. 509 (7501), 439-446 (2014).
  3. Campisi, J., d’Adda di Fagagna, F. Cellular senescence: when bad things happen to good cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (9), 729-740 (2007).
  4. Dimri, G., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 9363-9367 (1995).
  5. Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. The essence of senescence. Genes Dev. 24 (22), 2463-2479 (2010).
  6. Pospelova, T. V., et al. Pseudo-DNA damage response in senescent cells. Cell Cycle. 8 (24), 4112-4118 (2009).
  7. Narita, M., et al. Rb-mediated heterochromatin formation and silencing of E2F target genes during cellular senescence. Cell. 113 (6), 703-716 (2003).
  8. Ben-Porath, I., Weinberg, R. A. The signals and pathways activating cellular senescence. Int J Biochem Cell Biol. 37 (5), 961-976 (2005).
  9. Campisi, J. Senescent cells, tumor suppression, and organismal aging: good citizens, bad neighbors. Cell. 120 (4), 513-522 (2005).
  10. Coppe, J. P., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS Biol. 6 (12), 2853-2868 (2008).
  11. Tominaga-Yamanaka, K., et al. NF90 coordinately represses the senescence-associated secretory phenotype. Aging (Albany NY). 4 (10), 695-708 (2012).
  12. Wiley, C. D., et al. Mitochondrial Dysfunction Induces Senescence with a Distinct Secretory Phenotype. Cell Metab. 23 (2), 303-314 (2016).
  13. Hoare, M., et al. NOTCH1 mediates a switch between two distinct secretomes during senescence. Nat Cell Biol. 18 (9), 979-992 (2016).
  14. Rodier, F. Detection of the senescence-associated secretory phenotype (SASP). Methods Mol Biol. 965, 165-173 (2013).
  15. Srikantan, S., Marasa, B. S., Becker, K. G., Gorospe, M., Abdelmohsen, K. Paradoxical microRNAs: individual gene repressors, global translation enhancers. Cell Cycle. 10 (5), 751-759 (2011).
  16. Abdelmohsen, K., Gorospe, M. Noncoding RNA control of cellular senescence. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. , (2015).
  17. Bhaumik, D., et al. MicroRNAs miR-146a/b negatively modulate the senescence-associated inflammatory mediators IL-6 and IL-8. Aging. 1 (4), 402-411 (2009).
  18. Rodier, F., et al. DNA-SCARS: distinct nuclear structures that sustain damage-induced senescence growth arrest and inflammatory cytokine secretion. J Cell Sci. 124 (PT 1), 68-81 (2011).
  19. Bernardes de Jesus, B., Blasco, M. A. Assessing cell and organ senescence biomarkers. Circ Res. 111 (1), 97-109 (2012).
  20. Sharpless, N. E., Sherr, C. J. Forging a signature of in vivo senescence. Nat Rev Cancer. 15 (7), 397-408 (2015).
  21. Rubio, M. A., Kim, S. -. H., Campisi, J. Reversible Manipulation of Telomerase Expression and Telomere Length: implications for the ionizing radiation response and replicative senescence of human cells. J Biol Chem. 277 (32), 28609-28617 (2002).
  22. Chen, Q. M., Prowse, K. R., Tu, V. C., Purdom, S., Linskens, M. H. K. Uncoupling the Senescent Phenotype from Telomere Shortening in Hydrogen Peroxide-Treated Fibroblasts. Experimental Cell Research. 265 (2), 294-303 (2001).
  23. Dumont, P., et al. Induction of replicative senescence biomarkers by sublethal oxidative stresses in normal human fibroblast. Free Radic Biol Med. 28 (3), 361-373 (2000).
  24. Roninson, I. B. Tumor Cell Senescence in Cancer Treatment. Recherche en cancérologie. 63 (11), 2705-2715 (2003).
  25. Nyunoya, T., et al. Cigarette Smoke Induces Cellular Senescence. J Respir Cell Mol Biol. 35 (6), 681-688 (2006).
  26. Bai, H., Gao, Y., Hoyle, D. L., Cheng, T., Wang, Z. Z. Suppression of Transforming Growth Factor-β Signaling Delays Cellular Senescence and Preserves the Function of Endothelial Cells Derived From Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cells Transl Med. , (2016).
  27. Senturk, S., et al. Transforming growth factor-beta induces senescence in hepatocellular carcinoma cells and inhibits tumor growth. Hepatology. 52 (3), 966-974 (2010).
  28. Aird, K. M., Zhang, R. Detection of senescence-associated heterochromatin foci (SAHF). Methods Mol Biol. 965, 185-196 (2013).
  29. Pospelova, T. V., Chitikova, Z. V., Pospelov, V. A. An integrated approach for monitoring cell senescence. Methods Mol Biol. 965, 383-408 (2013).
  30. Di Micco, R., et al. Interplay between oncogene-induced DNA damage response and heterochromatin in senescence and cancer. Nat Cell Biol. 13 (3), 292-302 (2011).
  31. Wright, W. E., Pereira-Smith, O. M., Shay, J. W. Reversible cellular senescence: implications for immortalization of normal human diploid fibroblasts. Mol Cell Biol. 9 (7), 3088-3092 (1989).
  32. Bursuker, I., Rhodes, J. M., Goldman, R. Beta-galactosidase–an indicator of the maturational stage of mouse and human mononuclear phagocytes. J Cell Physiol. 112 (3), 385-390 (1982).
  33. Kopp, H. G., Hooper, A. T., Shmelkov, S. V., Rafii, S. Beta-galactosidase staining on bone marrow. The osteoclast pitfall. Histol Histopathol. 22 (9), 971-976 (2007).
  34. Witkiewicz, A. K., Knudsen, K. E., Dicker, A. P., Knudsen, E. S. The meaning of p16(ink4a) expression in tumors: functional significance, clinical associations and future developments. Cell Cycle. 10 (15), 2497-2503 (2011).
  35. Baker, D. J., et al. Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan. Nature. 530 (7589), 184-189 (2016).
  36. Baker, D. J., et al. Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders. Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).
  37. Demaria, M., et al. An Essential Role for Senescent Cells in Optimal Wound Healing through Secretion of PDGF-AA. Dev Cell. 31 (6), 722-733 (2014).
  38. Noren Hooten, N., et al. Metformin-mediated increase in DICER1 regulates microRNA expression and cellular senescence. Aging Cell. 15 (3), 572-581 (2016).
  39. Barzilai, N., Crandall, J. P., Kritchevsky, S. B., Espeland, M. A. Metformin as a Tool to Target Aging. Cell Metab. 23 (6), 1060-1065 (2016).
  40. Foretz, M., Guigas, B., Bertrand, L., Pollak, M., Viollet, B. Metformin: from mechanisms of action to therapies. Cell Metab. 20 (6), 953-966 (2014).
  41. Cahu, J., Sola, B. A sensitive method to quantify senescent cancer cells. J Vis Exp. (78), (2013).
  42. Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nat Protoc. 4 (12), 1798-1806 (2009).
  43. Noppe, G., et al. Rapid flow cytometric method for measuring senescence associated beta-galactosidase activity in human fibroblasts. Cytometry A. 75 (11), 910-916 (2009).
  44. Bassaneze, V., Miyakawa, A. A., Krieger, J. E. Chemiluminescent detection of senescence-associated beta galactosidase. Methods Mol Biol. 965, 157-163 (2013).
  45. Redon, C. E., et al. gamma-H2AX detection in peripheral blood lymphocytes, splenocytes, bone marrow, xenografts, and skin. Methods Mol Biol. 682, 249-270 (2011).
  46. Kosar, M., et al. Senescence-associated heterochromatin foci are dispensable for cellular senescence, occur in a cell type- and insult-dependent manner and follow expression of p16(ink4a). Cell Cycle. 10 (3), 457-468 (2011).
  47. Kennedy, A. L., et al. Senescent mouse cells fail to overtly regulate the HIRA histone chaperone and do not form robust Senescence Associated Heterochromatin Foci. Cell Div. 5, 16 (2010).

Tags

Cellular SenescenceSenescence InductionSenescence QuantificationGamma IrradiationSenescence-associated Beta-galactosidase AssayCell CultureMicroscopyImage Analysis
check_url/fr/55533?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Noren Hooten, N., Evans, M. K. Techniques to Induce and Quantify Cellular Senescence. J. Vis. Exp. (123), e55533, doi:10.3791/55533 (2017).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image