Technieken voor het induceren en te kwantificeren Cellulaire senescentie
Summary
Cellular veroudering, de onomkeerbare toestand van de celcyclus, kan worden geïnduceerd door verschillende cellulaire stress. Hier beschrijven we protocollen bij cellulaire veroudering en methoden ertoe te brengen markers van veroudering te beoordelen.
Abstract
In reactie op cellulaire stress of beschadiging, kan woekerende cellen van een specifiek programma dat een toestand van langdurige celcyclus initieert, de zogenaamde cellulaire veroudering veroorzaken. Accumulatie van verouderde cellen optreedt met organismal veroudering en door voortdurende kweken in vitro. Verouderde cellen beïnvloeden vele biologische processen, waaronder embryonale ontwikkeling, weefselherstel en regeneratie, tumor onderdrukking, en veroudering. Kenmerken van verouderde cellen omvatten, maar zijn niet beperkt tot, verhoogde senescentie-geassocieerde β-galactosidase-activiteit (SA-β-gal); p16 INK4A, p53 en p21 niveaus; hogere niveaus van DNA schade, waaronder γ-H2AX; de vorming van senescentie-geassocieerde Heterochromatine Foci (SAHF); en het verwerven van een senescentie geassocieerde fenotype secreet (SASP), een verschijnsel gekenmerkt door de secretie van een aantal pro-inflammatoire cytokines en signaalmoleculen. Hier beschrijven we protocollen voor zowel replicatieve enDNA schade geïnduceerde senescentie in gekweekte cellen. Daarnaast hebben we aandacht technieken om de senescent fenotype monitoren met behulp van verschillende senescentie-geassocieerde markers, inclusief SA-β-gal, γ-H2AX en SAHF kleuring, en eiwit- en mRNA-niveaus van celcyclus regulatoren en SASP factoren kwantificeren. Deze werkwijzen kunnen worden toegepast voor de beoordeling van senescentie in diverse uitvoeringen en weefsels.
Introduction
Meer dan een halve eeuw geleden, Hayflick en collega's beschreven hoe getransformeerde cellen vermeerderen in cultuur, maar slechts voor een beperkte periode 1. Lange-termijn kweken van menselijke fibroblasten veroorzaakt de cellen te stoppen uitdijende; echter, waren zij metabolisch actief, en dit werd cellulaire veroudering genoemd. Veroudering kan nuttig zijn voor het remmen van tumorigenese, maar het kan ook schadelijk zijn, aangezien het verondersteld bij te dragen aan het verlies van regeneratieve capaciteit die zich voordoet bij het ouder 2, 3. Verouderde cellen bleken te accumuleren in weefsels mens van 4 en zijn betrokken bij een aantal biologische processen, waaronder embryonale ontwikkeling, wondgenezing, weefselherstel, en leeftijdsgebonden ontsteking 2.
Continue passage van de cellen in de cultuur induceert replicatieve veroudering, die is gekoppeldom het natuurlijk verloop en genomische instabiliteit telomeer. Diverse cel onderstreept waaronder DNA schade en oncogenen, kunnen ook senescentie 3 veroorzaken. Veroudering aan andere oorzaken dan telomeerattritie factoren vaak stress geïnduceerde of voortijdige senescentie en afhankelijk van de p16 INK4A / Rb pathway 5 algemeen. Hoewel prolifererende ongetransformeerde cellen verschijnen typisch spindel vorm, kan verouderde cellen worden geïdentificeerd als zijnde bepaalde kenmerken, waaronder een vlak, groot morfologie en verhoogde senescentie geassocieerde β-galactosidase-activiteit (SA-β-gal) (figuren 1 en 2). Verouderde cellen accumuleren ook DNA- beschadiging merkers, waaronder γ-H2AX (figuur 3) 6, en mogelijk senescentie-geassocieerde heterochromatine foci (SAHF) (figuur 4) 7. Verouderde cellen hogere niveaus van celcyclus regulatoren, zoals p 16 (p16 INK4A) en / of p21 en p53 (Figuur 5) 8, 9. Bovendien hebben recente gegevens aangetoond dat verouderde cellen niet autonome effecten kunnen hebben door het afscheiden van een aantal pro-inflammatoire cytokines en chemokines genoemd senescentie-geassocieerde secretoir fenotype (SASP) 10. SASP hoewel dit verschijnsel kan van celtype tot celtype in het algemeen wordt aangetoond door een toename van Interleukine-6 (IL-6), IL-8, granulocyt-macrofaag koloniestimulerende factor (GM-CSF), groei- gereguleerde α oncogen (GRO-α), en GRO-β, onder andere (figuur 6). De bijzondere stress of schade induceert senescentie kunnen ook invloed op de secretoire fenotype 11, 12, 13. SASP kan worden gedetecteerd door het meten van de niveaus van uitgescheiden eiwitten via ELISA of cytokine / eiwitarrayss = "xref"> 10 14. Hoewel posttranscriptionele mechanismen SASP eiwitniveaus 11, kan reguleren 15, 16, 17, veranderingen in mRNA-niveaus kunnen worden gedetecteerd in vele gevallen. Deze veranderingen zijn over het algemeen gevoeliger en eenvoudiger te kwantificeren dan eiwitgehalte metingen. Andere verouderend merkers kunnen ook worden beoordeeld, waaronder blijvende DNA-beschadiging nucleaire foci, genoemd DNA-segmenten met chromatine wijzigingen versterkende veroudering (DNA-SCARS) 18, en verschillende andere markers 3, 19, 20.
We beschrijven gebruikelijke technieken voor het induceren senescentie van cellen in kweek alsook voor het meten van verscheidene merkers van veroudering, met inbegrip SA-β-Gal, γ-H2AX, SAHF en het eiwit en mRNA van senescence-geassocieerde moleculen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier hebben wij werkwijzen beschreven voor replicatieve en DNA-schade geïnduceerde senescentie waarbij menselijke diploïde fibroblasten. Bovendien kunnen technieken voor het kwantificeren van eiwit en mRNA-niveaus van verschillende senescentie-geassocieerde eiwitten zijn opgenomen, alsmede kleuring voor SA-β-gal en de DNA-schade merker γ-H2AX. Deze protocollen kan wijd om verouderende fenotypen zowel in vitro als in vivo te evalueren, hoewel veel restricties aanwezig voor het karakteriseren senesce…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door de Intramurale Research Program van de National Institutes of Health, National Institute on Aging. De auteurs willen Myriam Gorospe en Kotb Abdelmohsen bedanken voor de vele nuttige discussies over veroudering en Kotb Abdelmohsen voor ook het kritisch lezen van het manuscript. We danken ook ons laboratorium leden, met name Douglas Dluzen voor het kritisch lezen van het manuscript.
Materials
| 16% Tris-glycine gels | Invitrogen | XP00160BOX | |
| Acid-Phenol ChCl3 | Ambion | AM9720 | |
| Alexa-Fluor 568 goat anti-mouse antibody | Invitrogen | A11031 | 1:300 dilution |
| Cell lifters | Corning Inc. | 3008 | Cell scraper |
| ECL anti-mouse HRP linked antibody | Amersham | NA931V | |
| ECL Plus Western Blotting Substrate | Pierce | 32132 | ECL |
| DAPI | Molecular Probes | MP01306 | stock 5 mg/ml in dH2O |
| GAPDH antibody | Santa Cruz | sc-32233 | 1:1,000-5,000 dilution |
| GlycoBlue | Ambion | AM9515 | |
| Histone H3 dimethyl K9 monoclonal antibody | Abcam | 1220 | 1:500 dilution |
| Human IL-6 Quantikine ELISA assay | R&D systems | D6050 | |
| Human IL-8 Quantikine ELISA assay | R&D systems | D8000C | |
| Human GROa Quantikine ELISA assay | R&D systems | DRG00 | |
| N-N-dimethylformamide | Sigma | D4551 | DMF |
| p16 monoclonal antibody | BD Biosciences | 51-1325gr | 1:500 dilution |
| p21 monoclonal antibody | Millipore | 05-345 | 1:750 dilution |
| p53 monoclonal antibody | Santa Cruz | sc-126 | 1:500 dilution clone DO-1 |
| phospho-H2AX (Ser139) FITC conjugate antibody | Cell Signaling | 9719 | 1:2000 dilution |
| POWER SYBR-green PCR master mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| Pre-stained molecular weight markers | Biorad | 161-0374 | |
| ProLong Gold Antifade | Invitrogen | P36930 | |
| PVDF membrane | Thermo Scientific | 88518 | |
| Senescence b-Galactosidase Staining Kit | Cell Signaling | 9860 | |
| TRIzol | Ambion/Life Tech | 10296028 | |
References
- Hayflick, L. The Limited in Vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains. Exp Cell Res. 37, 614-636 (1965).
- van Deursen, J. M. The role of senescent cells in ageing. Nature. 509 (7501), 439-446 (2014).
- Campisi, J., d’Adda di Fagagna, F. Cellular senescence: when bad things happen to good cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (9), 729-740 (2007).
- Dimri, G., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 9363-9367 (1995).
- Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. The essence of senescence. Genes Dev. 24 (22), 2463-2479 (2010).
- Pospelova, T. V., et al. Pseudo-DNA damage response in senescent cells. Cell Cycle. 8 (24), 4112-4118 (2009).
- Narita, M., et al. Rb-mediated heterochromatin formation and silencing of E2F target genes during cellular senescence. Cell. 113 (6), 703-716 (2003).
- Ben-Porath, I., Weinberg, R. A. The signals and pathways activating cellular senescence. Int J Biochem Cell Biol. 37 (5), 961-976 (2005).
- Campisi, J. Senescent cells, tumor suppression, and organismal aging: good citizens, bad neighbors. Cell. 120 (4), 513-522 (2005).
- Coppe, J. P., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS Biol. 6 (12), 2853-2868 (2008).
- Tominaga-Yamanaka, K., et al. NF90 coordinately represses the senescence-associated secretory phenotype. Aging (Albany NY). 4 (10), 695-708 (2012).
- Wiley, C. D., et al. Mitochondrial Dysfunction Induces Senescence with a Distinct Secretory Phenotype. Cell Metab. 23 (2), 303-314 (2016).
- Hoare, M., et al. NOTCH1 mediates a switch between two distinct secretomes during senescence. Nat Cell Biol. 18 (9), 979-992 (2016).
- Rodier, F. Detection of the senescence-associated secretory phenotype (SASP). Methods Mol Biol. 965, 165-173 (2013).
- Srikantan, S., Marasa, B. S., Becker, K. G., Gorospe, M., Abdelmohsen, K. Paradoxical microRNAs: individual gene repressors, global translation enhancers. Cell Cycle. 10 (5), 751-759 (2011).
- Abdelmohsen, K., Gorospe, M. Noncoding RNA control of cellular senescence. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. , (2015).
- Bhaumik, D., et al. MicroRNAs miR-146a/b negatively modulate the senescence-associated inflammatory mediators IL-6 and IL-8. Aging. 1 (4), 402-411 (2009).
- Rodier, F., et al. DNA-SCARS: distinct nuclear structures that sustain damage-induced senescence growth arrest and inflammatory cytokine secretion. J Cell Sci. 124 (PT 1), 68-81 (2011).
- Bernardes de Jesus, B., Blasco, M. A. Assessing cell and organ senescence biomarkers. Circ Res. 111 (1), 97-109 (2012).
- Sharpless, N. E., Sherr, C. J. Forging a signature of in vivo senescence. Nat Rev Cancer. 15 (7), 397-408 (2015).
- Rubio, M. A., Kim, S. -. H., Campisi, J. Reversible Manipulation of Telomerase Expression and Telomere Length: implications for the ionizing radiation response and replicative senescence of human cells. J Biol Chem. 277 (32), 28609-28617 (2002).
- Chen, Q. M., Prowse, K. R., Tu, V. C., Purdom, S., Linskens, M. H. K. Uncoupling the Senescent Phenotype from Telomere Shortening in Hydrogen Peroxide-Treated Fibroblasts. Experimental Cell Research. 265 (2), 294-303 (2001).
- Dumont, P., et al. Induction of replicative senescence biomarkers by sublethal oxidative stresses in normal human fibroblast. Free Radic Biol Med. 28 (3), 361-373 (2000).
- Roninson, I. B. Tumor Cell Senescence in Cancer Treatment. Recherche en cancérologie. 63 (11), 2705-2715 (2003).
- Nyunoya, T., et al. Cigarette Smoke Induces Cellular Senescence. J Respir Cell Mol Biol. 35 (6), 681-688 (2006).
- Bai, H., Gao, Y., Hoyle, D. L., Cheng, T., Wang, Z. Z. Suppression of Transforming Growth Factor-β Signaling Delays Cellular Senescence and Preserves the Function of Endothelial Cells Derived From Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cells Transl Med. , (2016).
- Senturk, S., et al. Transforming growth factor-beta induces senescence in hepatocellular carcinoma cells and inhibits tumor growth. Hepatology. 52 (3), 966-974 (2010).
- Aird, K. M., Zhang, R. Detection of senescence-associated heterochromatin foci (SAHF). Methods Mol Biol. 965, 185-196 (2013).
- Pospelova, T. V., Chitikova, Z. V., Pospelov, V. A. An integrated approach for monitoring cell senescence. Methods Mol Biol. 965, 383-408 (2013).
- Di Micco, R., et al. Interplay between oncogene-induced DNA damage response and heterochromatin in senescence and cancer. Nat Cell Biol. 13 (3), 292-302 (2011).
- Wright, W. E., Pereira-Smith, O. M., Shay, J. W. Reversible cellular senescence: implications for immortalization of normal human diploid fibroblasts. Mol Cell Biol. 9 (7), 3088-3092 (1989).
- Bursuker, I., Rhodes, J. M., Goldman, R. Beta-galactosidase–an indicator of the maturational stage of mouse and human mononuclear phagocytes. J Cell Physiol. 112 (3), 385-390 (1982).
- Kopp, H. G., Hooper, A. T., Shmelkov, S. V., Rafii, S. Beta-galactosidase staining on bone marrow. The osteoclast pitfall. Histol Histopathol. 22 (9), 971-976 (2007).
- Witkiewicz, A. K., Knudsen, K. E., Dicker, A. P., Knudsen, E. S. The meaning of p16(ink4a) expression in tumors: functional significance, clinical associations and future developments. Cell Cycle. 10 (15), 2497-2503 (2011).
- Baker, D. J., et al. Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan. Nature. 530 (7589), 184-189 (2016).
- Baker, D. J., et al. Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders. Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).
- Demaria, M., et al. An Essential Role for Senescent Cells in Optimal Wound Healing through Secretion of PDGF-AA. Dev Cell. 31 (6), 722-733 (2014).
- Noren Hooten, N., et al. Metformin-mediated increase in DICER1 regulates microRNA expression and cellular senescence. Aging Cell. 15 (3), 572-581 (2016).
- Barzilai, N., Crandall, J. P., Kritchevsky, S. B., Espeland, M. A. Metformin as a Tool to Target Aging. Cell Metab. 23 (6), 1060-1065 (2016).
- Foretz, M., Guigas, B., Bertrand, L., Pollak, M., Viollet, B. Metformin: from mechanisms of action to therapies. Cell Metab. 20 (6), 953-966 (2014).
- Cahu, J., Sola, B. A sensitive method to quantify senescent cancer cells. J Vis Exp. (78), (2013).
- Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nat Protoc. 4 (12), 1798-1806 (2009).
- Noppe, G., et al. Rapid flow cytometric method for measuring senescence associated beta-galactosidase activity in human fibroblasts. Cytometry A. 75 (11), 910-916 (2009).
- Bassaneze, V., Miyakawa, A. A., Krieger, J. E. Chemiluminescent detection of senescence-associated beta galactosidase. Methods Mol Biol. 965, 157-163 (2013).
- Redon, C. E., et al. gamma-H2AX detection in peripheral blood lymphocytes, splenocytes, bone marrow, xenografts, and skin. Methods Mol Biol. 682, 249-270 (2011).
- Kosar, M., et al. Senescence-associated heterochromatin foci are dispensable for cellular senescence, occur in a cell type- and insult-dependent manner and follow expression of p16(ink4a). Cell Cycle. 10 (3), 457-468 (2011).
- Kennedy, A. L., et al. Senescent mouse cells fail to overtly regulate the HIRA histone chaperone and do not form robust Senescence Associated Heterochromatin Foci. Cell Div. 5, 16 (2010).
